تطوير نموذج عدوى حمار وحشي لـ Clostridioides difficile
Summary
عرض هنا هو وسيلة آمنة وفعالة لتصيب يرقات حمار وحشي مع اللاهوائية الفلورية C. difficile عن طريق الحقن المجهري وmicrogavage غير الباضعة.
Abstract
تعتبر عدوى كلوستريديديس difficile (CDI) واحدة من أكثر التهابات الجهاز الهضمي المرتبطة بالرعاية الصحية شيوعًا في الولايات المتحدة. وقد وصفت الاستجابة المناعية الفطرية ضد C. difficile، ولكن الأدوار الدقيقة للالعدلات والضامة في CDI هي أقل فهما. في الدراسة الحالية ، يتم استخدام يرقات Danio rerio (حمار وحشي) لإنشاء نموذج عدوى C. difficile لتصوير سلوك وتعاون هذه الخلايا المناعية الفطرية في الجسم الحي. لمراقبة C. difficile، تم إنشاء بروتوكول وضع العلامات باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم تحقيق عدوى موضعية عن طريق الحقن الدقيق المسمى C. difficile ، الذي ينمو بنشاط في الأمعاء حمار وحشي ويحاكي الضرر الظهاري المعوي في CDI. ومع ذلك ، فإن بروتوكول العدوى المباشرة هذا غازي ويسبب جروحًا مجهرية ، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية. وبالتالي ، يتم وصف بروتوكول microgavage أكثر غير الغازية هنا. تتضمن الطريقة تسليم خلايا C. difficile مباشرة إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي عن طريق التنبيب من خلال الفم المفتوح. هذه الطريقة العدوى تحاكي عن كثب مسار العدوى الطبيعية من C. difficile.
Introduction
C. difficile هو الغرام إيجابية, بوغ تشكيل, اللاهوائية, والسموم المنتجة للعصية التي هي السبب الرئيسي للالتهابات الشديدة في الجهاز الهضمي1. وتشمل الأعراض النموذجية لـ CDI الإسهال وآلام البطن والتهاب القولون الزائف القاتل ، ويمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى الموت1،2. وقد أظهرت الأدلة أن الاستجابات المناعية المضيفة تلعب دورا حاسما في كل من تطور ونتائج هذا المرض3. بالإضافة إلى الاستجابة المناعية ، فإن ميكروبيوتا الأمعاء الأصلية أمر بالغ الأهمية لبداية وإمراض CDI4. في العقد الماضي، زاد كل من عدد الحالات ومعدل الوفيات من CDI بشكل ملحوظ بسبب ظهور سلالة مفرطة من C. difficile (BI/NAP1/027)5،6. ومن شأن الفهم الأفضل لآليات المناعة الكامنة ودور الكائنات الحية المجهرية خلال مبادرة التنمية المجتمعية أن يساعد على النهوض بتطورات وتطورات علاجية جديدة، مما يتيح السيطرة على هذا الوباء بشكل أفضل.
وقد وضعت العديد من النماذج الحيوانية، مثل الهامستر والفأر، لتوفير نظرة ثاقبة في الدفاع المناعي ضد C. difficile7،8. ومع ذلك ، فإن دور الخلايا المناعية الفطرية لا يزال غير مفهوم بشكل جيد ، خاصة وأن سلوك الخلايا المناعية الفطرية مستمد بشكل رئيسي من التحليل النسيجي أو الخلايا المستزرعة في المختبر. ولذلك ، فإن إنشاء نموذج حمار وحشي شفاف للكشف عن الاستجابة المناعية الفطرية لC. difficile داخل كائن فقري حي سيسهل مثل هذه الدراسات. تحتوي يرقات حمار وحشي على نظام مناعة فطري وظيفي ، ولكنها تفتقر إلى الجهاز المناعي التكيفي حتى 4-6 أسابيع بعد الإخصاب9. هذه الميزة الفريدة تجعل يرقات سمك الحمار الوحشي نموذجًا ممتازًا لدراسة الاستجابة المعزولة ووظيفة الخلايا المناعية الفطرية في CDI.
يصف هذا التقرير طرقًا جديدة باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية المفحلة والفطرية، مثل الضامة والالعدلات. أولاً، يتم تقديم بروتوكول حقن دقيق موضعي يتضمن C. inoculum وتلطيخ. باستخدام في التصوير الفاصل بين الوقت في الجسم الحي ، يتم تسجيل استجابة العدلات والضامة تجاه موقع العدوى ، ويلاحظ البلعوم من البكتيريا عن طريق العدلات والضامة. ومع ذلك ، فقد أفيد أن الحقن نفسه يسبب تلف الأنسجة ويؤدي إلى تجنيد الكريات البيض مستقلة عن البكتيريا10. لذلك ، يتم وصف بروتوكول microgavage غير الباضع لتسليم C. difficile إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي في وقت لاحق. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الميكروبات المعدية المعوية الأصلية حماية مضيف ضد استعمار C. difficile11. لذلك ، تستخدم يرقات حمار وحشي gnotobiotic أيضًا لتهيئ ة سمك الحمار الوحشي المصاب 12. بعد ذلك ، يتم إجراء تشريح الأمعاء لاستعادة قابلة للحياة C. difficile والتحقق من مدة وجودها في المسالك المعوية حمار وحشي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المقدمة تعديل وتوسيع نهج القائمة لتصيب يرقات حمار وحشي عن طريق تنفيذ كل من الحقن وmicrogavage10،14. كما أنه يوضح نهج لدراسة مسببات الأمراض اللاهوائية مع يرقات حمار وحشي22. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل البروتوكول تحليل استجابات الخلايا المناعية ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لتيمو فريتش لرعاية الحيوانات الممتازة. نشكر أعضاء مختبرات كوستر وستينرت على دعمهم ومناقشاتهم المفيدة. نشكر الدكتور داندان هان على قراءته النقدية للمخطوطة. ونحن نقدر بامتنان التمويل من قبل الدولة الاتحادية من ولاية سكسونيا السفلى، Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
