이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.
합성 세포의 건설을위한 상향식 조립 방법은 세포를 모방 한 환경에서 세포 과정을 격리하고 조사하기위한 효과적인 도구입니다. 더욱이, 세포 없는 발현 시스템의 발달은 합성 생물학을 활용하는 통제된 방식으로 단백질 생산, 전사 및 번역 과정(DNA→RNA→단백질)을 재구성하는 능력을 입증하였다. 여기에서 우리는 강력한 세균 용해물의 생산을 포함하여 세포 자유 발현 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고, 합성 세포를 형성하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 지질 기지를 둔 거대한 unilamellar 소포 (GUV) (즉, 안정한 리포솜) 안쪽에 이 용해물을 캡슐화합니다. 이 프로토콜은 활성 세균 용해물의 생산을 포함하는 합성 세포의 성분을 제조하는 방법을 설명하고, 이어서 수중 오일 에멀젼 전달 방법에 기초하여 합성 세포의 상세한 단계별 제조를 기술한다. 이들은 단백질의 다른 모형을 생산하기 위한 높은 다양성으로 간단하고 적당한 방법으로 합성 세포의 수백만의 생산을 촉진합니다. 얻어진 합성 세포는 고립된 환경에서 단백질/RNA 생산 및 활동을 조사하기 위하여, 지시된 진화에서, 또한 바디 안쪽에 치료 단백질의 온디맨드 생산을 위한 통제된 약 납품 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.
합성 세포는 인공 세포와 같은 입자로서, 유전자 코드1,,2,,3에기초하여 단백질을 분열, 포름, 합성하는 능력과 같은 살아있는 세포의 하나 또는 다중 기능을 모방한다. 무세포 단백질 합성 (CFPS) 시스템을 둘러싸는 합성 세포는 DNA 템플릿의 변경 에 따라 다양한 단백질과 RNA 서열을 생산하는 능력으로 인해 높은 모듈성을 가지고 있습니다. 단백질 생산의 현재 접근법에 대한 매력적인 대안을 제시하는 CFPS 시스템은 세포 용해물, 정제 성분 또는 합성 성분을 기반으로 하며 리보솜, RNA 폴리머라제, 아미노산 및 에너지 원(예를 들어, 3-인산성산염 및 아데닌5,6,7,8,트리포스페이트)과 같은 단백질 합성에 필요한 모든 전사 및 번역 기계를4,포함합니다.9 지질 소포 내부의 CFPS 시스템의 캡슐화는 살아있는 세포(10)에의존하지 않고 단백질의 간단하고 효율적인 생산을 가능하게한다. 더욱이, 이 플랫폼은 천연 세포 내부의 분해될 수 있는 펩타이드의 합성을 허용하고, 살아있는 세포에 독성이 있는 단백질의 생산을 허용하며, 비천연 아미노산11,,12로단백질을 수정한다. 합성 세포는 진화적 관점에서 세포 생명을 가능하게 하는 데 필요한 최소한의 세포 성분을 조사하는 연구 목적으로 모델로 사용되어 왔다1,,13. 합성 세포는 또한 유전 회로를 구축하고 구현하는 데 사용되었으며 지시 된 진화14,,15,,16을위한모델로 사용되었습니다. 다른 연구는 당뇨병 환자에서 베타 세포와 같은 손상된 천연 세포를 대체하는 것을 목표로 천연 세포의 생물학적 활성을 모방하는 합성 세포의 능력에 초점을 맞추고있다 17. 더욱이, 다양한 치료 단백질을 생산하는 합성 세포를 캡슐화하는 이러한 CFPS의 능력은 임상 용법18에통합될 수 있는 잠재력을 보여준다.
여기서 우리는 지질 소포에 캡슐화된 CFPS 시스템에 기초한 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 생산을 위한 상향식 실험실 스케일프로토콜(그림 1)을기술한다. 이는 생체내 치료 단백질 약물의 현장 생산을 위한 신규한 약물 전달 시스템으로서 합성 세포 플랫폼의 잠재적 사용을 보여준다19. 이전 연구는 CFPS 반응및 세포 리세이트 제제 과정의 최적화를조사한 4,,8,,20. 더욱이, 미유체 및 중합체 계,물방울 안정화 방법21,22,,23,리포좀 의 지질 조성물24,25,26과 같은 세포 크기의 리포좀 제제에 여러 기술이 적용되었다.,, 제시된 프로토콜에서, 합성 세포는 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하여 제조되고 캡슐화 과정은 저온(&4°C)5,,10,,24,,27,,28에서수행된다. 이러한 온화한 조건은 분자 기계, 즉 리보솜 및 단백질27,,29,,30의생체 기능 적 무결성을 유지하는 데 유리한 것으로 밝혀졌다. 입자의 지질 조성물은 콜레스테롤과 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)으로 구성된다. 첫 번째는 모든 포유류 세포막에서 발견되며 멤브레인의 안정성, 강성 및 투과성 감소에 필수적이며, 후자는 포유류 인지질 조성물11,,13을모방한다. 세포 전사 및 번역 분자 기계는 BL21 (DE3) 대장균 (대장균) 균주에서 추출되며, 이는 pAR1219 플라스미드로 변형되어 T7 RNA 폴리머라제와 함께 변형되어 CFPS 효능 및 단백질 합성을 증가시킵니다. 이 시스템은 생체외 및 생체내19,,31의분자량으로 진단 및 치료 단백질을 생산하는 데 사용되었습니다. 다음 프로토콜은 합성 세포 시스템의 생산을 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 본질적으로 단백질 합성과 관련된 광범위한 근본적인 문제를 해결할 수 있으며 약물 전달 응용 분야에도 활용될 수 있다.
이 프로토콜은 다량의 단백질 생산 합성 세포를 생산하기 위한 간단하고 저렴한 방법을 소개합니다. 활성 세포의 수율은 몇 가지 중요한 단계에 중점을 둔 프로토콜의 신중하고 정확한 실행에 달려 있습니다. 이 방법의 분해 제제 섹션에서, 세균 분해에 충분한 양의 단백질을 달성하기 위해 세포 가포하기 전에 적절한 박테리아 밀도에 도달하는 것이 필수적이다. 둘째, 용해 과정은 단백질 활성을…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 ERC-STG-2015-680242에 의해 지원되었다.
저자는 또한 테크니온 통합 암 센터 (TICC)의 지원을 인정; 러셀 베리 나노 기술 연구소; 로리 I. 로키 생명 과학 및 공학 학제 센터; 카민 그랜트에 대한 이스라엘 경제부 (52752); 이스라엘 과학기술우주부 – 수석과학자실 (3-11878); 이스라엘 과학 재단 (1778/13, 1421/17); 이스라엘 암 협회 (2015-0116); GIF 젊은 교부금을위한 과학 연구 개발을위한 독일 – 이스라엘 재단 (I-2328-1139.10/2012); 경력 통합 교부금에 대한 유럽 연합 FP-7 IRG 프로그램 (908049); 인지질 연구 센터 그랜트; 암 연구를위한 로젠 블라트 재단, 말라트 가족 재단 보조금; 그리고 Unger 가족 재단. A. 슈뢰더는 알론과 타우브 펠로우십을 인정한다. O. 아디르는 셔먼과 구트위르트의 펠로우십을 인정한다. G. 첸은 셔먼 펠로우십을 인정한다. N. 크린스키는 로스차일드 제왕절개 재단의 바론스 아리안 드 로스차일드 여성 박사 과정에 대해 인정합니다.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |