인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성
Summary
혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.
Abstract
혈액 뇌 장벽 (BBB) 신경 혈관 단위에 의해 형성 된다 (NV) 그 중추 신 경계를 보호 (CNS) 미묘한 뇌 기능을 방해할 수 있는 혈액에서 발견 하는 요인의 범위에서. 이와 같이, BBB는 CNS에 치료제의 전달에 주요 장애물이다. 축적 된 증거는 BBB가 신경 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. 따라서, CNS 표적 약물의 침투를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 해명할 수 있는 BBB 모형을 위한 엄청난 필요가 있습니다.
우리는 최근에 인간에게 완전히 개인화된 BBB 칩을 생성하기 위하여 기관 온 칩 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 기술을 결합했습니다. 이 새로운 플랫폼은 인간 BBB를 통해 약물 및 분자 수송의 예측에 적합한 세포, 분자 및 생리학적 특성을 표시합니다. 또한 환자 별 BBB 칩을 사용하여 신경 질환 모델을 생성하고 개인화 된 예측 의학 응용 프로그램의 잠재력을 입증했습니다. 여기에 제공된 iPSC 유래 BBB 칩을 생성하는 방법을 보여주는 상세한 프로토콜이 제공되며, iPSC 유래 뇌 미세 혈관 내피 세포(iBMECs)의 분화로 시작하여 신경 전구를 함유하는 혼합 신경 배양물의 결과로 시작되며, 차별화 된 뉴런, 및 성상 세포. 또한 조절된 층류 하에서 장기 칩 내로 세포를 시드하고 BBB 칩을 배양하는 절차도 기술되어 있다. 마지막으로, BBB 칩 분석에 대한 상세한 설명은 칩 내의 세포 유형의 조성을 결정하기 위한 면역세포화학적 방법뿐만 아니라 약물 및 분자 투과성을 평가하기 위한 파라셀룰러 투과성 분석법을 포함한다.
Introduction
BBB는 순환 혈액에서 CNS를 분리하는 높게 선택적인 방벽입니다. 그것은 잠재적으로 파괴적인 물질에서 중요 한 뇌 기능을 보호, 요인, 그리고 또한 영양소와 뇌 항상성을 유지 하는 데 필요한 다른 대사 산물의 유입을 허용 하는 동안1. BBB는 다세포 NVU로서 골상세포, 성상세포 종보 및 신경 과정이 뇌 미세 혈관 내피 세포(BMECs)와 직접 접촉합니다. 이러한 상호 작용을 통해 BMECs는접합부2,3에의해 지지되는 특수 장벽 특성을 형성할 수 있습니다. 이 방벽의 대형은 분자의 paracellular 통행을 제한합니다, 그러나 능동적으로 CNS로 분자를 수송하기 위하여 편광한 수송자를 포함합니다 또는 혈액으로 다시1. 이러한 독특한 장벽 특성으로 인해 BBB는 바이오 의약품을 뇌로 전달하는 데 큰 장애가 되며 FDA 승인 소분자의 5% 미만이 CNS4에도달할 수 있는 것으로 추정됩니다.
동물 모델은 BBB 개발5에관여하는 BBB 침투 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 동물 모델은 생체 내 복잡한 다세포 환경을 충실하게 나타내지만, BBB 수송기의 발현 및 활성의 차이뿐만 아니라 종에 걸친 기질 특이성의 차이는 종종 인간에게 동물 데이터의 정확한 외삽을배제한다 6. 따라서, 인간 기반 모델은 인간 BBB를 연구하고 CNS를 표적으로 하도록 설계된 약물의 개발에 사용하기 위해 중요하다. 이러한 필요성은 제약 개발 분야에서 생물학적, 인간 특이적 약물의 지배력이 증가함에 따라 더욱 명백해집니다. 축적된 증거는 손상된 BBB가 뇌종양 및 신경질환을 포함하는 다수의 중증 CNS 질환과 연관되어 있음을 시사한다7,8,9. 이러한 질병을 충실하게 반영하는 인간 모델은 1) 약물 개발을 목표로 할 수 있는 새로운 경로를 식별하고 2) CNS 침투를 예측하여 전임상 연구에서 시간과 자원을 줄이고 임상 시험에서 실패율을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
시험관내 모델은 BMECs와 NVU의 다른 세포 들 사이의 상호 작용을 연구하고 장래 BBB 투과성 약물에 대한 스크린을 수행하기 위해 널리 구현되어 왔다10. 인간 BBB의 주요 측면을 재현하기 위해, 시험관 내 모델은 생리학적으로 관련된 특성을 표시해야 합니다(즉, 낮은 파라셀세포 투과성 및 생리학적으로 관련된 형벌 전기 저항 [TEER] 내피 단층에 걸쳐). 또한, 시험관내 시스템의 분자 프로파일은 대표적인 기능적 수송 시스템의 발현을 포함해야 한다. 전형적으로, 시험관내 모델은 BBB특성(11)을향상시키기 위해 다른 NVU 세포의 조합과 함께 반투과성 막 상에서 배양되는 내피 세포로 구성된다. 이 접근법은 장벽 기능과 분자 투과성을 간단하고 비교적 신속하게 평가할 수 있게 합니다. 이러한 세포 기반 BBB 모델은 외과 적 절제 또는 불멸의 BMEC 라인으로부터 분리된 세포를 포함하는 동물 또는 인간 세포 공급원으로 확립될 수 있다.
최근, 인간 다능성 세포를 BMECs로 분화하는 프로토콜이 시험관 내 인간 BBB모델(12,13)에대한 매력적인 공급원으로 도입되었다. 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 BMECs(iBMECs)는 확장성이 높고, 인간 BBB의 중요한 형태학적 및 기능적 특성을 입증하고, 환자의 유전학을 수행한다. 문화에서 iBMECs는 단단한 접합 마커를 표현하고 생체내 접합 단지에 표시하는 단층을 형성합니다. 이들 세포는 또한 BBB 포도당 수송기, 포도당 수송기 1(GLUT1)을 포함하는 BBB 마커를 발현한다. 중요한 것은, 인간 BMECs에 대한 다른 대체 세포 소스와는 달리, iBMECs는 생체 내 측정값과 높은 값으로 장벽 특성을획득,basolateral 축을 따라 편광, 및 기능성 유출 펌프를 표현. 더욱이, 다양한 피험자들로부터의 iPSCs의 사용은 모두 1) 개인화된 의학 방식으로 BBB의 양상을 시험할 수 있는 기회를 환영하고 2) NVU의 추가적인 세포 유형을 생성하기 위한 유연한 공급원을 제공한다. 개인화된 BBB 칩을 만들기 위하여 이 세포를 동위 원성 세포 근원에서 생성하는 것은 또한 임상 연구 결과에서 관찰된 처리에 저항 또는 손상한 반응에 대한 주요 원인인 약 반응에 있는 개별적인 다름을 이해하는 것을 도울 것입니다.
접시 나 반 투과성 트랜스웰 인서트에 단일 레이어로 iBMECs를 사용하는 것은 BBB 모델링을위한 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 시스템은 견고하고 재현 가능하며 비용 효율적인 경향이 있습니다. 또한 TEER 및 투과성과 같은 기능 분석은 비교적 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 2차원(2D) 시스템은 생체 내 조직의 3D 특성을 재현하지 못하고, 혈액 및 혈액 세포를 순환시킴으로써 제공되는 생리학적 전단 응력이 부족하다. 이것은 본질적인 BBB 속성 및 기능을 개발하고 유지하기 위하여 이 모형에 있는 관 내피의 기능을 제한합니다.
살아있는 세포에 의해 줄 지어 있는 마이크로 엔지니어링 시스템은 오르간 온 칩에게 불린 개념에 있는 각종 기관 기능을 모델링하기 위하여 실행되었습니다. 생체외 다세포 구조, 조직-조직 인터페이스, 물리 화학 적 미세 환경 및 혈관 관류를 재현함으로써 이러한 마이크로 엔지니어링 플랫폼은 조직 및 장기 기능 수준을 생성할 수 없습니다. 기존의 2D 배양 시스템. 그(것)들은 또한 생체 내 조직 및 기관 문맥에 있는 살아있는 세포와 유사한 생화확적인, 유전 및 신진 대사 단면도의 고해상도, 실시간 화상 진찰 및 분석을 가능하게 합니다. 그러나 오르간 온 칩의 특별한 과제는 이러한 마이크로 엔지니어링 칩의 설계, 제작 및 적용에는 생물학적 지향적인 학술 실험실에서 일반적으로 부족한 전문 엔지니어링 전문 지식이 필요하다는 것입니다.
우리는 최근에 개인화 된 BBB 칩 모델15,16을생성하기 위해 iPSC 및 오르간 온 칩 기술을 결합했습니다. 기술적인 과제를 극복하기 위해 시판되는 Chip-S1은 간단하고 견고한 방식으로 칩의 유지관리를 자동화하도록 설계된 계측기인 배양 모듈과 함께 사용됩니다(Emulate Inc.). BBB 칩은 신경 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용을 재현하고 통합 금 전극17과사용자 정의 만든 장기 칩에 의해 측정되는 생리적으로 관련된 TEER 값을 달성한다. 또한 BBB 칩은 낮은 세포 투과성을 표시하고, 기관 수준에서 염증 신호에 반응하고, 활성 유출 펌프를 표현하며, 수용성 바이오마커 및 바이오 의약품의 예측 수송을 나타냅니다. 특히, 여러 개인으로부터 생성된 BBB 칩은 건강한 개인과 신경질환 환자 사이의 예상 기능적 차이를포착한다 15.
아래에 자세히 설명된 프로토콜은 동적 흐름 조건에서 인간 iPSC 기반 BBB 칩의 생성을 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 재현 가능한 방법을 설명합니다. BBB 칩또는 샘플링 유출물에서 직접 수행할 수 있는 분석 유형 및 종점 분석에 대한 지침이 제공됩니다. 따라서, 프로토콜은 인간 관련 모델에서 생물학적 및 기능적 특성 및 반응을 평가하기 위해 적용될 수 있는 기술의 스펙트럼을 보여준다.
iPSC 기반 BBB 칩에 대한 간략한 설명은 여기에 제공됩니다. 인간 iPSCs는 처음에 조직 배양 플라스크에서 EZ 구라고 불리는 신경 전구의 자유 부동 응집체로서 분화되고 전파됩니다. Chip-S116,18,19의 최상위 채널은 칩의 “뇌 측”을 형성하는 해리된 EZ 구체로 시드되며, 세포는 7일 동안 신경 전구 세포(iNPC), iAstrocytes 및 iNeurons의 혼합 배양으로 분화됩니다. 인간 iPSCs는 또한 iBMECs로 조직 배양 판에서 분화됩니다. 칩의 하단 채널은 iBMECs로 시드되어 내피 튜브를 형성하기 위해 발달함에 따라 “혈액 측”을 형성합니다(그림 1). 상하 채널 1을 분리하는 다공성 세포 외 매트릭스(ECM) 코팅 멤브레인은 채널과 2 사이의 세포 간 상호 작용의 형성을 허용하며, 사용자는 기존의 광 현미경을 사용하여 어느 채널에서든 투과성 세포 및 이미지 세포를 실행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NVU의 장기 온 칩 기술과 iPSC 유래 세포의 조합은 인간 BBB의 정확한 모델링에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 여기서는 최근에 게시된 iPSC 기반 BBB 칩16의간단하고 강력한 응용을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 시드 패러다임의 개요와 타이밍은 그림 3에나와 있습니다. BBB 모델링에 적합한 장벽 함수를 획득하고 유지관리하려면 균일한 iBMEC 단층을 생?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중요한 편집에 대해 소샤나 스벤센 박사님께 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 보조금 에 의해 지원되었다 1621/18, 과학 기술부 (MOST), 이스라엘 3-15647, 재생 의학 교부금 ID ID1-08800, 셔먼 가족 재단, NIH-NINDS 교부금 1UG3NS105703, 및 ALS 협회 보조금 18-SI-389. AH는 발렌베르크 재단(교부금 번호 2015.0178)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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