הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום
Summary
מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.
Abstract
מחסום מוח הדם (BBB) נוצר על ידי יחידות נוירוכלי (הבוס) כי מגן על מערכת העצבים המרכזית (CN) מתוך מגוון של גורמים שנמצאו בדם שיכול לשבש את תפקוד המוח העדין. ככזה, BBB הוא מכשול גדול להעברת therapeutics לתוך ה-CN. צבירת ראיות עולה כי BBB משחק תפקיד מפתח בתחילתה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות. לפיכך, יש צורך אדיר במודל BBB שיכול לחזות את החדירה של תרופות ממוקדות-CN, כמו גם להבהיר את תפקידה של BBB בבריאות ובמחלות.
יש לנו לאחרונה שילבו איבר על שבב והמושרה תא גזע pluriפוטנטי (iPSC) טכנולוגיות לייצר שבב BBB אישית מלאה לבני אדם. פלטפורמת הרומן מציגה תכונות סלולריות, מולקולריות ופיזיולוגיות המתאימות לחיזוי העברת הסמים והמולקולה ברחבי BBB האנושי. יתר על כן, באמצעות שבבי BBB ספציפי לחולה, יצרנו מודלים של מחלות נוירולוגיות והפגינו פוטנציאל עבור יישומים מותאמים אישית לרפואה חזוי. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט הממחיש כיצד לייצר שבבי BBB נגזר, החל בבידול של iPSC-נגזר מיקרוכלי המוח של תאים אנדותל (iBMECs) וכתוצאה מכך תרבויות עצביות מעורבת המכילה ושלתי עצביים, נוירונים הבדיל, ו astrocytes. כמו כן, מתוארת הליך לזריעת תאים לתוך שבב העוגב ולקבלת שבבי BBB תחת זרימה מבוקרת של שכבתית. לבסוף, תיאורים מפורטים של ניתוחי השבבים BBB מסופקים, כולל הפרפרביליות הפרסומליות להערכת תרופות וחדירות מולקולה, כמו גם שיטות אימונוציטוטוקוכימיקלים לקביעת ההרכב של סוגי תאים בתוך השבב.
Introduction
BBB הוא מחסום סלקטיבי מאוד המפריד בין ה-CN לדם ממחזור הדם. הוא מגן על פונקציות המוח קריטי מפני חומרים הפרעה פוטנציאלי, גורמים, ו xenobiotics בעוד מאפשר זרם של חומרים מזינים ומטבוליטים אחרים הדרושים כדי לשמור על הומאוסטזיס המוח1. ה-BBB הוא מדור שינה (NVU), בו הננו-כפות הרגליים והתהליכים העצביים מגעים ישירות עם תאי המוח מיקרוכלי-דם (BMECs). אינטראקציות אלה מאפשרות ל-bmecs ליצור מאפייני מכשול מיוחדים הנתמכים על-ידי צמתים הדוקים ומחסיד2,3. היווצרות של המכשול הזה מגביל את המעבר הפרתאי של מולקולות, אבל הוא מכיל מובילי מקוטב כדי להעביר באופן פעיל מולקולות לתוך ה-CN או בחזרה לדם1. בשל מאפייני המכשול הייחודיים הללו, BBB מהווה מכשול גדול להעברת הביופרמקולוגיה למוח, וההערכה היא שפחות מ -5% ממולקולות קטנות באישור ה-FDA יכולים להגיע ל-CN4.
דגמי בעלי חיים שימשו רבות לחקר החדירה BBB והמנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח BBB5. בעוד מודלים בעלי חיים מייצגים בנאמנות את מורכבות משולבת בסביבה vivo, הבדלים ביטוי ופעילות של מובילי BBB כמו גם ספציפיות מצע על פני מינים לעתים קרובות למנוע התרוממות מדויקת של נתונים בעלי חיים לבני אדם6. לפיכך, מודלים מבוססי-אדם הם קריטיים כדי ללמוד את BBB האנושי ולשימוש בפיתוח תרופות המיועדות למקד את ה-CN. צורך זה הופך להיות אפילו יותר ברור עם שליטה גוברת של תרופות ביולוגיות, ספציפיות לאדם בתחום הפיתוח הפרמצבטי. צבירת ראיות מרמזת כי bbb פרוצים קשורה למספר הפרעות המוח החמורות, כולל גידולים בראש ומחלות נוירולוגיות7,8,9. המודלים האנושיים בנאמנות משקפים מחלות אלה יש פוטנציאל שני 1) לזהות מסלולים הרומן שיכול להיות ממוקד עבור פיתוח התרופה 2) לחזות החדירה של ה-CN, ובכך הפחתת זמן ומשאבים במחקרים פרה-קליניים ואולי ירידה בשיעור כישלון בניסויים קליניים.
במודלים של חוץ גופית יושמו באופן נרחב כדי ללמוד אינטראקציות בין BMECs לבין תאים אחרים של NVU ומסכי התנהלות עבור תרופות לחדירות BBB פוטנציאליים10. כדי ליצור מחדש היבטים מרכזיים של BBB האנושי, במודלים החוץ-גופית חייבים להציג מאפיינים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (דהיינו, חדירות הקרנף נמוכות והתנגדות מבחינה פיזיולוגית הקשורה לטראנס-תל-שורש). בנוסף, הפרופיל המולקולרי של מערכת החוץ-גופית חייב לכלול ביטוי למערכות התחבורה הפונקציונלית הייצוגית. בדרך כלל, במודלים של חוץ גופית מורכבים בתאי האנדותל כי הם משותפים על קרום למחצה חדיר עם שילובים של תאים NVU אחרים כדי לשפר את מאפייני BBB11. גישה זו מאפשרת הערכה פשוטה ומהירה יחסית של פונקציונליות המכשול וחדירות המולקולה. מודלים אלה מבוססי תא BBB ניתן להקים עם בעל חיים או מקורות תא אדם, כולל תאים מבודדים excisions כירורגי או קווי BMEC מונצח.
לאחרונה, פרוטוקולים כדי להבדיל בין התאים האנושיים החזקים לתוך bmecs הוצגו כמקור אטרקטיבי עבור מודלים bbb האנושי מתורבת12,13. תא גזע מושרה pluripotent (iPSC)-נגזר מסכת הנגזרת (iBMECs) הם מדרגיים מאוד, להפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים חיוניים של BBB האדם, ולשאת את הגנטיקה של המטופל. בתרבות, iBMECs ליצור מונאולייר כי מבטא סמנים הצומת הדוקה מציג vivo-כמו מתחמי הצומת הדוקה. תאים אלה גם מבטאים סמנים BBB, כולל משגר הגלוקוז BBB, הגלוקוז המוביל 1 (GLUT1). חשוב מכך, ובניגוד מקורות אחרים תאים חלופיים עבור האדם BMECs, iBMECs לרכוש מאפייני המכשול עם ערכים גבוהים כמו אלה שנמדדו ב vivo14, מקטפולז לאורך הציר בזלת צלעות, ומשאבות לבטא פונקציונלי מהיר. יתר על כן, השימוש iPSCs מתוך נושאים שונים שני 1) מברך את ההזדמנות לבחון היבטים של BBB באופן מותאם אישית התרופה 2) מספק מקור גמיש ליצירת סוגים נוספים של תאים של NVU. יצירת תאים אלה ממקור תא איזוגניים כדי ליצור שבבי BBB אישית תסייע גם הבנה בין הבדלים בין בודדים בתגובות התרופה, שהיא מטרה מרכזית לתגובה התנגדות או פרוצים לטיפול נצפתה במחקרים קליניים.
שימוש ב-iBMECs כמו monolayers בתבשיל או על הוספת מעבר חדיר למחצה מייצגת גישה רבת עוצמה עבור מידול BBB. מערכות אלה נוטות להיות חזקות, מיועלות וחסכוניות. בנוסף, ניתוחים פונקציונליים כגון הפרטיר והחדירות הם פשוטים יחסית לביצוע. עם זאת, דו מימדי (2D) מערכות לא לחזור לסדר את הטבע 3D של רקמת vivo, ואין להם את הכוח הפיזיולוגי להדגיש כוחות שסופקו על ידי במחזור דם ותאי דם. הדבר מגביל את יכולת האנדותל של כלי הדם במודלים אלה כדי לפתח ולתחזק מאפיינים ופונקציות מהותיים של BBB.
מערכות מיקרו הנדסה מרופדת על ידי תאים חיים יושמו למודל האיברים השונים שונים במושג שנקרא עוגב-על-צ’יפס. על-ידי יצירה מיוצרת של אדריכלות מvivo כמו, ממשקי רקמה רקמה, מיקרוקוכימיה פיסיוכימיקלים, ו perfusion כלי דם, אלה פלטפורמות מיקרו מהונדסים ליצור רמות של רקמות ואיברים פונקציונליות לא אפשרי עם מערכות התרבות 2D קונבנציונאלי. הם גם מאפשרים ברזולוציה גבוהה, הדמיה בזמן אמת, ניתוח של פרופילים ביוכימיים, גנטיים, ומטבוליים דומים לתאי החיים בתוך רקמת vivo והקשר עוגב. עם זאת, אתגר מסוים של האיבר על שבב הוא העיצוב, ייצור, ויישום של שבבי מיקרו מהונדסים אלה דורש מומחיות הנדסה מיוחדת כי הוא בדרך כלל חסר במעבדות האקדמיות מונחה ביולוגית.
לאחרונה שילבו ipsc וטכנולוגיות עוגב-על-שבב כדי ליצור מודל מותאם אישית של שבב bbb15,16. על מנת להתגבר על האתגרים הטכנולוגיים שתוארו, השבב הזמין מסחרית משמש יחד עם מודול התרבות, מכשיר שנועד להפוך את התחזוקה של האסימונים בצורה פשוטה ואיתנה (הדמיית Inc.). שבב BBB משחזר את האינטראקציות בין תאים עצביים ואנדותל ומשיגה את ערכי העגלון הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הנמדדת על ידי שבבי עוגב מותאמים אישית עם אלקטרודות זהב משולבות17. בנוסף, שבב BBB מציג חדירות הקרנף נמוך, מגיב לרמזים דלקתיים ברמת האיבר, מבטא משאבות מיצוי פעיל, ומציג הובלה חזוי של ביוארים מסיסים וביופרמצבטיקה. בעיקר, שבבי BBB שנוצרו ממספר אנשים לוכדת את ההבדלים הפונקציונליים צפוי בין אנשים בריאים וחולים עם מחלות נוירולוגיות15.
הפרוטוקול המפורט להלן מתאר שיטה אמינה, יעילה ובעלת שדרוג ליצירת שבבי BBB מבוססי-האדם בתנאי זרימה דינמיים. ההדרכה מסופקת על סוג של מנתח וניתוח נקודות הקצה שניתן לבצע ישירות בשבב BBB או מדגימת קולחים. לפיכך, הפרוטוקול ממחיש את הספקטרום של טכניקות שניתן ליישם להערכת תכונות ביולוגיות ופונקציונליות ותגובות במודל הרלבנטי לאדם.
המלון מספק תיאור קצר של שבב BBB המבוסס על iPSC. האדם iPSCs הם הבדיל בתחילה והופץ בתוך מבחנות התרבות רקמות כמו אגרגטים בחינם צף של ושלתי עצביים, כינה כדורי EZ. הערוץ העליון של השבב-S116,18,19 הוא נזרע עם הנתק EZ-כדורים שיוצרים את “הצד המוח” של השבב, כמו תאים להבדיל מעל 7 ימים לתוך תרבות מעורבת של תאים מחולל קדמון (inpcs), iastrocytes, ו ineurons. האדם iPSCs גם מובחנת לוחיות התרבות רקמות לתוך iBMECs. הערוץ התחתון של השבב הוא הנזרע עם iBMECs כדי ליצור את “הצד הדם” כפי שהם מפתחים כדי ליצור צינורית אנדותל (איור 1). מטריצה נקבובי מגולוון (ecm) מצופה קרום המפריד בין הערוצים העליונים והתחתונים 1) מתיר את היווצרות אינטראקציות תא אל התא בין ערוצים ו 2) מאפשר למשתמש להפעיל חדירות בחני התאים התמונה באחד הערוצים באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השילוב של הטכנולוגיה לעוגב-על-שבב ותאי iPSC-נגזר ב-NVU מחזיקה הבטחה למידול מדויק של BBB האנושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יישום פשוט וחזק של שבב BBB מבוסס לאחרונה שפורסם iPSC16. סקירה ותזמון של פרדיגמת הזריעה מוצגת באיור 3. כדי להשיג ולשמור על פונקציות המכשול המ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות לד ר סושנה סזוסן לעריכה קריטית. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המדע הישראלי מענק 1621/18, משרד המדע והטכנולוגיה (רוב), ישראל 3-15647, המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית המענק DISC1-08800, קרן משפחת שרמן, NIH-NINDS מענק 1יום 3NS105703, ואת האגודה ALS מענק 18-SI-389. AH מומן על ידי קרן ולנברג (גרנט מספר 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
