Generation av en mänsklig iPSC-baserade Blod-Brain Barriär Chip
Summary
Blod – hjärnbarriären (BBB) är en multicellulär neurovaskulär enhet som i tät en tid reglerar hjärnans homeostas. Genom att kombinera humana iPSCs och organ-on-chip-teknik har vi genererat ett personligt BBB-chip, lämpligt för sjukdomsmodellering och CNS-läkemedelspenetrability förutsägelser. Ett detaljerat protokoll beskrivs för generering och drift av BBB-chippet.
Abstract
Blodhjärnbarriären (BBB) bildas av neurovaskulära enheter (NVUs) som skyddar det centrala nervsystemet (CNS) från en rad faktorer som finns i blodet som kan störa känslig hjärnfunktion. BBB är därför ett stort hinder för leverans av therapeutics till CNS. Ackumulerande bevis tyder på att BBB spelar en nyckelroll i uppkomsten och utvecklingen av neurologiska sjukdomar. Således finns det ett enormt behov av en BBB modell som kan förutsäga penetration av CNS-riktade läkemedel samt belysa BBB: s roll i hälsa och sjukdom.
Vi har nyligen kombinerat organ-on-chip och inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) för att generera ett BBB-chip helt personligt för människor. Denna nya plattform visar cellulära, molekylära och fysiologiska egenskaper som är lämpliga för förutsägelse av läkemedels- och molekyltransporter över den mänskliga BBB. Dessutom, med hjälp av patientspecifika BBB-chips, har vi genererat modeller av neurologisksjukdom och visat potentialen för personliga prediktiva läkemedel applikationer. Förutsatt här är ett detaljerat protokoll som visar hur man genererar iPSC-härledda BBB-chips, som börjar med differentiering av iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller (iBMECs) och resulterar i blandade neurala kulturer som innehåller neurala progenitorer, differentierade nervceller och astrocyter. Också beskrivs är ett förfarande för sådd celler i organchip et och odling av BBB-flisunder kontrollerade laminarflöde. Slutligen ges detaljerade beskrivningar av BBB-spånanalyser, inklusive paracellulära permeabilitetsanalyser för bedömning av läkemedels- och molekylpermeabilitet samt immunocytokemiska metoder för att bestämma sammansättningen av celltyper inom chippet.
Introduction
BBB är en mycket selektiv barriär som skiljer CNS från det cirkulerande blodet. Det skyddar kritiska hjärnfunktioner från potentiellt störande ämnen, faktorer och xenobiotika samtidigt som tillströmningen av näringsämnen och andra metaboliter som krävs för att upprätthålla hjärnan homeostas1. BBB är en multicellulära NVU där pericyter, astrocyter endfeet och neuronala processer direkt kontakt hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs). Dessa interaktioner gör det möjligt för BMECs att bilda specialiserade barriäregenskaper som stöds av snäva och vidhäftningar korsningar2,3. Bildandet av denna barriär begränsar den paracellulära passagen av molekyler, men den innehåller polariserade transportörer för att aktivt transportera molekyler till CNS eller tillbaka in i blodet1. På grund av dessa unika barriäregenskaper utgör BBB ett stort hinder för leverans av biofarmaceutiska läkemedel i hjärnan, och det uppskattas att mindre än 5% av FDA-godkända små molekyler kan nå CNS4.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning för att studera BBB penetrance och de molekylära mekanismer som deltar i BBB utveckling5. Medan djurmodeller troget representerar den komplexa multicellulära in vivo-miljön, utesluter skillnader i uttryck och aktivitet av BBB-transportörer samt substratspecificitet mellan arter ofta korrekt extrapolering av djurdata till människor6. Således är människobaserade modeller avgörande för att studera den mänskliga BBB och för användning i utvecklingen av läkemedel som syftar till att rikta CNS. Detta behov blir ännu tydligare med den ökande dominansen av biologiska, människospecifika läkemedel på läkemedelsutvecklingsområdet. Ackumulerande bevis tyder på att en komprometterad BBB är associerad med ett antal allvarliga CNS störningar, inklusive hjärntumörer och neurologiska sjukdomar7,8,9. Mänskliga modeller återspeglar troget dessa sjukdomar har potential att både 1) identifiera nya vägar som kan riktas mot läkemedelsutveckling och 2) förutsäga CNS penetrance, vilket minskar tid och resurser i prekliniska studier och eventuellt minska felfrekvensen i kliniska prövningar.
In vitro-modeller har genomförts i stor utsträckning för att studera interaktioner mellan BMECs och andra celler i NVU och genomföra skärmar för potentiella BBB-genomsläppliga läkemedel10. För att återskapa viktiga aspekter av den mänskliga BBB måste in vitro-modeller visa fysiologiskt relevanta egenskaper (dvs. låg paracellulära permeabilitet och fysiologiskt relevant transendotelelektriskresistens [TEER] över endotelmonolayer). Dessutom måste den molekylära profilen för ett in vitro-system innehålla uttryck för representativa funktionella transportsystem. Typiskt, in vitro modeller består av endotelceller som är samodlade på ett semipermeable membran med kombinationer av andra NVU celler för att förbättra BBB egenskaper11. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel och relativt snabb bedömning av barriärfunktionalitet och molekylpermeabilitet. Sådana cellbaserade BBB-modeller kan upprättas med djur- eller mänskliga cellkällor, inklusive celler som isolerats från kirurgiska excisions eller förevigade BMEC-linjer.
Nyligen infördes protokoll för att differentiera mänskliga pluripotenta celler i BMECs som en attraktiv källa för in vitro mänskliga BBB modeller12,13. Inducerad pluripotent stamcells (iPSC)-härledda BMECs (iBMECs) är mycket skalbara, visar avgörande morfologiska och funktionella egenskaper hos den mänskliga BBB, och bär genetik en patient. I kulturen bildar iBMECs ett monolayer som uttrycker snäva kopplingsmarkörer och visar in vivo-liknande snäva kopplingskomplex. Dessa celler uttrycker också BBB-markörer, inklusive BBB glukostransportör, glukostransportör 1 (GLUT1). Viktigt, och till skillnad från andra alternativa cellkällor för mänskliga BMECs, iBMECs förvärva barriäregenskaper med värden så högt som de mätt in vivo14, polarisera längs basolateral axeln, och uttrycka funktionella efflux pumpar. Dessutom välkomnar användningen av iSP:er från olika ämnen båda 1) möjligheten att testa aspekter av BBB på ett personligt medicinsätt och 2) en flexibel källa för att generera ytterligare celltyper av NVU. Generera dessa celler från en isogenic cell källa för att skapa personliga BBB-chips skulle också bidra till att förstå mellan individuella skillnader i läkemedelssvar, vilket är en viktig orsak till resistens eller äventyras svar på behandling som observerats i kliniska studier.
Användning av iBMECs som monolayers i en maträtt eller på en halv permeable transwell infoga representerar en kraftfull metod för BBB modellering. Dessa system tenderar att vara robusta, reproducerbara och kostnadseffektiva. Dessutom är funktionella analyser som TEER och permeabilitet relativt enkla att utföra. Emellertid, tvådimensionella (2D) system misslyckas med att sammanfatta 3D-karaktären av in vivo vävnad, och de saknar fysiologiska skjuvning stresskrafter som cirkulerar blod och blodkroppar. Detta begränsar kärlens förmåga att utveckla och underhålla inneboende BBB-egenskaper och funktioner.
Mikrokonstruerade system kantade av levande celler har implementerats för att modellera olika organfunktioner i ett koncept som kallas organ-on-chips. Genom att återskapa in vivo-liknande multicellulär arkitektur, vävnadsvävnadsgränssnitt, fysicokemiska mikromiljöer och vaskulär perfusion, genererar dessa mikrokonstruerade plattformar nivåer av vävnads- och organfunktionalitet som inte är möjlig med konventionella 2D-kultursystem. De möjliggör också högupplöst, realtidsavbildning och analys av biokemiska, genetiska och metaboliska profiler som liknar levande celler i in vivovävnad och organsammanhang. Men en särskild utmaning av organ-on-chip är att design, tillverkning och tillämpning av dessa mikrokonstruerade chips kräver specialiserad teknisk expertis som vanligtvis saknas i biologiskt orienterade akademiska laboratorier.
Vi har nyligen kombinerat iPSC och organ-on-chip-teknik för att generera en personlig BBB chip modell15,16. För att övervinna de tekniska utmaningar som beskrivs används det kommersiellt tillgängliga Chip-S1 tillsammans med kulturmodulen, ett instrument som är utformat för att automatisera underhållet av chipsen på ett enkelt och robust sätt (Emulate Inc.). BBB-chippet återskapar interaktioner mellan neurala och endotelceller och uppnår fysiologiskt relevanta TEER-värden, som mäts av skräddarsydda organchips med integrerade guldelektroder17. Dessutom visar BBB-chipet låg paracellulära permeabilitet, svarar på inflammatoriska signaler på organnivå, uttrycker aktiva effluxpumpar och uppvisar prediktiva transporter av lösliga biomarkörer och biofarmaceutiska läkemedel. Noterbart är att BBB-chips som genereras från flera individer fångar de förväntade funktionella skillnaderna mellan friska individer och patienter med neurologiska sjukdomar15.
I protokollet nedan beskrivs en tillförlitlig, effektiv och reproducerbar metod för generering av mänskliga iPSC-baserade BBB-chips under dynamiska flödesförhållanden. Vägledning ges om vilken typ av analyser och slutpunktsanalyser som kan utföras direkt i BBB-chippet eller från provtagningsspillvatten. Således visar protokollet spektrumet av tekniker som kan tillämpas för att utvärdera biologiska och funktionella egenskaper och svar i en människa-relevant modell.
Här finns en kort beskrivning av det iPSC-baserade BBB-chippet. Mänskliga iPSCs differentieras ursprungligen och förökas i vävnadsodlingsflaskor som fritt flytande aggregat av neurala progenitorer, kallade EZ-sfärer. Den övre kanalen i Chip-S116,18,19 är sådd med separerade EZ-sfärer som bildar “hjärnan sidan” av chip, som celler skiljer över 7 dagar i en blandad kultur av neurala stamceller (iNPCs), iAstrocyter och iNeurons. Mänskliga iPSCs är också differentierade i vävnadsodlingplattor i iBMECs. Den nedre kanalen av chipet är seedade med iBMECs att bilda “blodsidan” som de utvecklas för att bilda en endotelrör(figur 1). Den porösa extracellulära matrisen (ECM)-belagda membran som separerar de övre och nedre kanalerna 1) tillåter bildandet av cell-till-cell interaktioner mellan kanaler och 2) gör det möjligt för användaren att köra permeabilitet analyser och bildceller i båda kanalerna med hjälp av ett konventionellt ljusmikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kombinationen av organ-on-chip-teknik och iPSC-härledda celler i NVU håller löfte om korrekt modellering av den mänskliga BBB. Här ger vi ett detaljerat protokoll för enkel och robust tillämpning av den nyligen publicerade iPSC-baserade BBB chip16. En översikt och tidpunkt för sådd paradigm visas i figur 3. För att erhålla och underhålla barriärfunktioner som är lämpliga för BBB-modellering är det avgörande att generera ett homogent iBMEC-monoskikt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka dr Soshana Svendsen för kritisk redigering. Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation bidrag 1621/18, ministeriet för vetenskap och teknik (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine bevilja ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS bevilja 1UG3NS105703, och ALS Association bevilja 18-SI-389. AH finansierades av Wallenberg Foundation (bidragsnummer 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
