Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip
Summary
De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.
Abstract
De bloedhersenbarrière (BBB) wordt gevormd door neurovasculaire eenheden (ASO’s) die het centrale zenuwstelsel (CNS) beschermen tegen een reeks factoren in het bloed die de delicate hersenfunctie kunnen verstoren. Als zodanig vormt de BBB een groot obstakel voor de levering van therapeutica aan het CNS. Accumulerend bewijs suggereert dat de BBB een belangrijke rol speelt bij het ontstaan en de progressie van neurologische ziekten. Zo is er een enorme behoefte aan een BBB-model dat de penetratie van CNS-gerichte geneesmiddelen kan voorspellen en de rol van de BBB in gezondheid en ziekte kan verduidelijken.
We hebben onlangs organ-on-chip en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën gecombineerd om een BBB-chip te genereren die volledig gepersonaliseerd is voor mensen. Dit nieuwe platform toont cellulaire, moleculaire en fysiologische eigenschappen die geschikt zijn voor de voorspelling van drugs- en molecuultransport over de menselijke BBB. Bovendien hebben we met behulp van patiëntspecifieke BBB-chips modellen van neurologische ziekte gegenereerd en het potentieel voor gepersonaliseerde voorspellende geneeskundetoepassingen aangetoond. Hier is een gedetailleerd protocol dat aantoont hoe iPSC-afgeleide BBB-chips kunnen worden gegenereerd, te beginnen met differentiatie van iPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen (iBC’s) en resulterend in gemengde neurale culturen die neurale voorlopers bevatten, gedifferentieerde neuronen en astrocyten. Ook beschreven is een procedure voor het zaaien van cellen in de orgaanchip en het kweken van de BBB-chips onder gecontroleerde laminaire stroom. Ten slotte worden gedetailleerde beschrijvingen van BBB-chipanalyses verstrekt, waaronder paracellulaire doorlaatbaarheidstesten voor de beoordeling van de doorlaatbaarheid van geneesmiddelen en moleculen en immunocytochemische methoden voor het bepalen van de samenstelling van celtypen binnen de chip.
Introduction
De BBB is een zeer selectieve barrière die het CNS scheidt van het circulerende bloed. Het beschermt kritieke hersenfuncties tegen potentieel storende stoffen, factoren en xenobiotica, terwijl ook de instroom van voedingsstoffen en andere metabolieten die nodig zijn om de hersenen homeostase te behouden1. De BBB is een meercellige NVU waarin pericytes, astrocyte endfeet en neuronale processen rechtstreeks contact opnemen met hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs). Deze interacties stellen BMECs in staat om gespecialiseerde barrière-eigenschappen te vormen die worden ondersteund door strakke en aanhangende knooppunten2,3. De vorming van deze barrière beperkt de paracellulaire passage van moleculen, maar het bevat gepolariseerde transporters om actief moleculen in het CNS of terug in het bloed te transporteren1. Als gevolg van deze unieke barrière eigenschappen, de BBB vormt een groot obstakel voor de levering van biofarmaceutica in de hersenen, en er wordt geschat dat minder dan 5% van de FDA-goedgekeurde kleine moleculen kan de CNS4te bereiken.
Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt om BBB penetrance en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij BBB ontwikkeling5te bestuderen. Terwijl diermodellen getrouw de complexe meercellige in vivo omgeving vertegenwoordigen, sluiten verschillen in expressie en activiteit van BBB-transporters en substraatspecificiteit tussen soorten vaak een nauwkeurige extrapolatie van dierlijke gegevens naar de mens uit6. Zo zijn op mensen gebaseerde modellen van cruciaal belang om de menselijke BBB te bestuderen en voor gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen die zijn ontworpen om het CNS te targeten. Deze behoefte wordt nog duidelijker met de toenemende dominantie van biologische, mensspecifieke geneesmiddelen op het gebied van farmaceutische ontwikkeling. Accumulerend bewijs suggereert dat een gecompromitteerde BBB wordt geassocieerd met een aantal ernstige CNS-aandoeningen, waaronder hersentumoren en neurologische aandoeningen7,8,9. Menselijke modellen getrouw als gevolg van deze ziekten hebben het potentieel om zowel 1) nieuwe trajecten die kunnen worden gericht voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren en 2) voorspellen CNS penetrantie, waardoor de tijd en middelen in preklinische studies en eventueel afnemende percentage mislukkingen in klinische studies.
In vitro modellen zijn op grote schaal geïmplementeerd om interacties tussen BMECs en andere cellen van de NVU te bestuderen en schermen uit te voeren voor potentiële BBB-doorlatende geneesmiddelen10. Om belangrijke aspecten van de menselijke BBB na te bootsen, moeten in vitro modellen fysiologisch relevante eigenschappen (d.w.z. lage paracellulaire permeabiliteit en fysiologisch relevante transendotheliale elektrische weerstand [TEER] over de endothelialmonolayer) weergeven. Bovendien moet het moleculaire profiel van een in vitro systeem de expressie van representatieve functionele transportsystemen omvatten. Typisch, in vitro modellen zijn samengesteld uit endotheliale cellen die co-gekweekt op een semipermeabel membraan met combinaties van andere NVU cellen om BBB eigenschappen te verbeteren11. Deze aanpak maakt een eenvoudige en relatief snelle beoordeling van barrièrefunctionaliteit en molecuuldoorlaatbaarheid mogelijk. Dergelijke op cellen gebaseerde BBB-modellen kunnen worden vastgesteld met dierlijke of menselijke celbronnen, waaronder cellen geïsoleerd van chirurgische excisions of vereeuwigde BMEC-lijnen.
Onlangs werden protocollen om menselijke pluripotente cellen te onderscheiden in BMECs geïntroduceerd als een aantrekkelijke bron voor in vitro menselijke BBB-modellen12,13. Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide BMECs (iBMECs) zijn zeer schaalbaar, tonen cruciale morfologische en functionele kenmerken van de menselijke BBB aan en dragen de genetica van de patiënt. In de cultuur vormen iBMECs een monolayer die strakke verbindingsmarkeringen en displays uitdrukt in vivo-achtige strakke knooppuntcomplexen. Deze cellen drukken ook BBB-markers uit, waaronder de BBB glucosetransporter, glucosetransporter 1 (GLUT1). Belangrijk is, en in tegenstelling tot andere alternatieve celbronnen voor menselijke BMECs, iBMECs verwerven barrière eigenschappen met waarden zo hoog als die gemeten in vivo14, polariseren langs de basolaterale as, en uitdrukken functionele efflux pompen. Bovendien is het gebruik van iPSCs van verschillende onderwerpen beide 1) verwelkomt de mogelijkheid om aspecten van de BBB te testen in een gepersonaliseerde geneeskunde manier en 2) biedt een flexibele bron voor het genereren van extra celtypes van de NVU. Het genereren van deze cellen uit een isogene celbron om gepersonaliseerde BBB-chips te maken, zou ook helpen bij het begrijpen van inter individuele verschillen in medicijnreacties, wat een belangrijke oorzaak is voor resistentie of gecompromitteerde respons op behandeling die in klinische studies wordt waargenomen.
Het gebruik van iBMECs als monolagen in een schaal of op een semi doorlaatbare transwell insert is een krachtige aanpak voor BBB modellering. Deze systemen zijn meestal robuust, reproduceerbaar en kosteneffectief. Daarnaast zijn functionele analyses zoals TEER en doorlaatbaarheid relatief eenvoudig uit te voeren. Echter, tweedimensionale (2D) systemen niet aan de 3D-aard van in vivo weefsel recapituleren, en ze missen de fysiologische afschuif stress krachten die door circulerende bloed en bloedcellen. Dit beperkt het vermogen van het vasculaire endotheel in deze modellen om intrinsieke BBB-eigenschappen en -functies te ontwikkelen en te behouden.
Micro-engineered systemen bekleed door levende cellen zijn geïmplementeerd om verschillende orgaanfunctionaliteiten te modelleren in een concept genaamd organ-on-chips. Door in vivo-achtige meercellige architectuur, weefsel-weefselinterfaces, fysischchemische microomgevingen en vasculaire perfusie opnieuw te creëren, genereren deze micro-engineered platforms niveaus van weefsel- en orgaanfunctionaliteit die niet mogelijk zijn met conventionele 2D-kweeksystemen. Ze maken ook hoge resolutie, real-time beeldvorming en analyse van biochemische, genetische en metabole profielen mogelijk die vergelijkbaar zijn met levende cellen in de in vivo weefsel- en orgaancontext. Echter, een bijzondere uitdaging van de organ-on-chip is dat het ontwerp, fabricage, en de toepassing van deze micro-engineered chips vereist gespecialiseerde technische expertise die meestal ontbreekt in biologisch georiënteerde academische laboratoria.
We hebben onlangs iPSC en organ-on-chip technologieën gecombineerd om een gepersonaliseerd BBB chip model15,16te genereren. Om de beschreven technologische uitdagingen het hoofd te bieden, wordt de commercieel beschikbare Chip-S1 gebruikt samen met de cultuurmodule, een instrument dat is ontworpen om het onderhoud van de chips op een eenvoudige en robuuste manier te automatiseren (Emulate Inc.). De BBB-chip reconstrueert interacties tussen neurale en endotheelcellen en bereikt fysiologisch relevante TEER-waarden, die worden gemeten door op maat gemaakte orgaanchips met geïntegreerde gouden elektroden17. Bovendien vertoont de BBB-chip een lage paracellulaire permeabiliteit, reageert hij op ontstekingssignalen op orgaanniveau, drukt actieve efflux-pompen uit en vertoont het voorspellend transport van oplosbare biomarkers en biofarmaceutica. Met name BBB-chips gegenereerd van verschillende individuen vangt de verwachte functionele verschillen tussen gezonde individuen en patiënten met neurologische aandoeningen15.
Het onderstaande protocol beschrijft een betrouwbare, efficiënte en reproduceerbare methode voor de generatie van menselijke iPSC-gebaseerde BBB-chips onder dynamische stroomomstandigheden. Er wordt richtlijnen gegeven over het type tests en eindpuntanalyses die direct in de BBB-chip of van bemonsteringseffluent kunnen worden uitgevoerd. Zo toont het protocol het spectrum van technieken die kunnen worden toegepast voor de evaluatie van biologische en functionele eigenschappen en reacties in een voor de mens relevant model.
Een korte beschrijving van de iPSC-gebaseerde BBB chip is hier aanwezig. Menselijke iPSCs worden in eerste instantie gedifferentieerd en gepropageerd in weefselkweekkolven als vrij zwevende aggregaten van neurale voorlopers, ez-bollen genoemd. Het bovenste kanaal van de Chip-S116,18,19 is gezaaid met gescheiden EZ-bollen die de “hersenkant” van de chip vormen, omdat cellen zich onderscheiden over 7 dagen in een gemengde cultuur van neurale voorlopercellen (iNPC’s), iAstrocyten en iNeurons. Menselijke iPSC’s worden ook gedifferentieerd in weefselkweekplaten in iBMECs. Het onderste kanaal van de chip is gezaaid met iBMECs om de “bloedzijde” te vormen als ze zich ontwikkelen tot een endotheelbuis(figuur 1). De poreuze extracellulaire matrix (ECM)-gecoate membraan dat de boven-en onderkant kanalen scheidt 1) maakt de vorming van cel-cel-cel interacties tussen kanalen en 2) kan de gebruiker permeability testen en beeldcellen draaien in beide kanalen met behulp van een conventionele lichtmicroscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De combinatie van organ-on-chip technologie en iPSC-afgeleide cellen in de NVU belooft een nauwkeurige modellering van de menselijke BBB. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige en robuuste toepassing van de onlangs gepubliceerde iPSC-gebaseerde BBB-chip16. Een overzicht en timing van het zaaiparadigma is te zien in figuur 3. Het verkrijgen en behouden van barrièrefuncties die geschikt zijn voor BBB-modellering, het genereren van een homogene iBMEC-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Soshana Svendsen bedanken voor de kritische montage. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation subsidie 1621/18, het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST), Israël 3-15647, het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde subsidie ID DISC1-08800, de Sherman Family Foundation, NIH-NINDS subsidie 1UG3NS105703, en De ALS Association subsidie 18-SI-389. AH werd gefinancierd door Stichting Wallenberg (subsidienummer 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
