Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips
Summary
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.
Abstract
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) wird durch neurovaskuläre Einheiten (NVUs) gebildet, die das zentrale Nervensystem (ZNS) vor einer Reihe von Faktoren im Blut abschirmen, die die empfindliche Gehirnfunktion stören können. Daher stellt die BBB ein großes Hindernis für die Abgabe von Therapeutika an das ZNS dar. Die sich anhäufenden Beweise deuten darauf hin, dass die BBB eine Schlüsselrolle beim Beginn und Fortschreiten neurologischer Erkrankungen spielt. Daher besteht ein enormer Bedarf an einem BBB-Modell, das die Penetration von CNS-gezielten Medikamenten vorhersagen und die Rolle des BBB bei Gesundheit und Krankheit aufklären kann.
Wir haben vor kurzem Organ-on-Chip und induzierte pluripotente Stammzell -Technologien (iPSC) kombiniert, um einen BBB-Chip zu erzeugen, der vollständig für den Menschen personalisiert ist. Diese neuartige Plattform zeigt zelluläre, molekulare und physiologische Eigenschaften, die für die Vorhersage des Arzneimittel- und Molekültransports über den menschlichen BBB geeignet sind. Darüber hinaus haben wir mit patientenspezifischen BBB-Chips Modelle neurologischer Erkrankungen generiert und das Potenzial für personalisierte Prädiktive Medizinanwendungen demonstriert. Hier ist ein detailliertes Protokoll, das zeigt, wie iPSC-abgeleitete BBB-Chips erzeugt werden können, beginnend mit der Differenzierung von iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen (iBMECs) im Gehirn und der Daraus resultierenden gemischten neuronalen Kulturen, die neuronale Vorläufer enthalten, differenzierte Neuronen und Astrozyten. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Aussaat von Zellen in den Organchip und zur Kultivierung der BBB-Chips unter kontrolliertem laminaren Fluss. Schließlich werden detaillierte Beschreibungen der BBB-Chipanalysen bereitgestellt, einschließlich parazellulärer Permeabilitätstests zur Beurteilung der Wirkstoff- und Moleküldurchlässigkeit sowie immunzytochemische Methoden zur Bestimmung der Zusammensetzung von Zelltypen innerhalb des Chips.
Introduction
Die BBB ist eine hochselektive Barriere, die das ZNS vom zirkulierenden Blut trennt. Es schützt kritische Gehirnfunktionen vor potenziell störenden Substanzen, Faktoren und Xenobiotika und ermöglicht gleichzeitig den Zustrom von Nährstoffen und anderen Metaboliten, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns erforderlich sind1. Die BBB ist eine multizelluläre NVU, in der Pericyte, Astrozytenendfüße und neuronale Prozesse direkt mit mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) im Gehirn in Kontakt treten. Diese Interaktionen ermöglichen es BMECs, spezielle Barriereeigenschaften zu bilden, die durch enge und haftetende Knoten unterstützt werden2,3. Die Bildung dieser Barriere begrenzt den parazellulären Durchgang von Molekülen, aber es enthält polarisierte Transporter, um Moleküle aktiv in das ZNS oder zurück ins Blut zu transportieren1. Aufgrund dieser einzigartigen Barriereeigenschaften stellt die BBB ein großes Hindernis für die Lieferung von Biopharmazeutika in das Gehirn dar, und es wird geschätzt, dass weniger als 5% der von der FDA zugelassenen kleinen Moleküle das ZNS4erreichen können.
Tiermodelle wurden häufig verwendet, um BBB-Penetranz und die molekularen Mechanismen der BBB-Entwicklung zu untersuchen5. Während Tiermodelle die komplexe multizelluläre In-vivo-Umgebung getreu darstellen, schließen Unterschiede in Expression und Aktivität von BBB-Transportern sowie die speziesspezifitätsspezifisch oft eine genaue Extrapolation von Tierdaten auf den Menschenaus 6. Daher sind humanbasierte Modelle entscheidend für die Untersuchung des menschlichen BBB und für den Einsatz bei der Entwicklung von Medikamenten, die auf das ZNS abzielen. Diese Notwendigkeit wird durch die zunehmende Dominanz biologischer, humanspezifischer Arzneimittel im Bereich der pharmazeutischen Entwicklung noch deutlicher. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass ein kompromittierter BBB mit einer Reihe von schweren ZNS-Erkrankungen verbunden ist, einschließlich Hirntumoren und neurologischen Erkrankungen7,8,9. Menschliche Modelle, die diese Krankheiten getreu widerspiegeln, haben das Potenzial, sowohl 1) neue Wege zu identifizieren, die für die Arzneimittelentwicklung gezielt werden könnten, als auch 2) Die Penetranz von ZNS vorherzusagen, wodurch Zeit und Ressourcen in präklinischen Studien reduziert und möglicherweise die Ausfallrate in klinischen Studien verringert wird.
In-vitro-Modelle wurden weit verbreitet, um Wechselwirkungen zwischen BMECs und anderen Zellen der NVU zu untersuchen und Bildschirme für prospektive BBB-durchlässige Medikamente10durchzuführen. Um Schlüsselaspekte des menschlichen BBB nachzubilden, müssen In-vitro-Modelle physiologisch relevante Eigenschaften aufweisen (d. h. geringe parazelluläre Durchlässigkeit und physiologisch relevanter transendotheliale elektrischer Widerstand [TEER] über die endotheliale Monoschicht). Darüber hinaus muss das molekulare Profil eines In-vitro-Systems die Expression repräsentativer funktioneller Transportsysteme umfassen. Typischerweise bestehen In-vitro-Modelle aus Endothelzellen, die auf einer semipermeablen Membran mit Kombinationen anderer NVU-Zellen kokultiviert werden, um die BBB-Eigenschaften zu verbessern11. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und relativ schnelle Beurteilung der Barrierefunktionalität und der Moleküldurchlässigkeit. Solche zellbasierten BBB-Modelle können mit tierischen oder menschlichen Zellquellen hergestellt werden, einschließlich Zellen, die aus chirurgischen Exzisionen oder verewigten BMEC-Linien isoliert sind.
Kürzlich wurden Protokolle zur Unterscheidung menschlicher pluripotenter Zellen in BMECs als attraktive Quelle für in vitro humane BBB-Modelle12,13eingeführt. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete BMECs (iBMECs) sind hochgradig skalierbar, zeigen entscheidende morphologische und funktionelle Eigenschaften des menschlichen BBB und tragen die Genetik des Patienten. In der Kultur bilden iBMECs eine Monoschicht, die enge Anschlussmarkierungen ausdrückt und in vivo-ähnlichen engen Kreuzungskomplexen anzeigt. Diese Zellen exprimieren auch BBB-Marker, einschließlich des BBB-Glukosetransporters, Glukosetransporter 1 (GLUT1). Wichtig ist, und im Gegensatz zu anderen alternativen Zellquellen für menschliche BMECs erfassen iBMECs Barriereeigenschaften mit Werten, die so hoch sind wie die in vivo14gemessenen, polarisieren entlang der basolateralen Achse und drücken funktionale Effluxpumpen aus. Darüber hinaus begrüßt die Verwendung von iPSCs aus verschiedenen Fächern beide 1) die Möglichkeit, Aspekte der BBB in einer personalisierten Medizin-Manier zu testen und 2) bietet eine flexible Quelle für die Erzeugung zusätzlicher Zelltypen der NVU. Die Erzeugung dieser Zellen aus einer isogenen Zellquelle zur Erstellung personalisierter BBB-Chips würde auch helfen, interindividuelle Unterschiede in den Arzneimittelreaktionen zu verstehen, was eine Hauptursache für Resistenzen oder eine kompromittierte Reaktion auf die in klinischen Studien beobachtete Behandlung ist.
Die Verwendung von iBMECs als Monolayer in einer Schale oder auf einem halbdurchlässigen Transwell-Einsatz stellt einen leistungsstarken Ansatz für die BBB-Modellierung dar. Diese Systeme sind in der Regel robust, reproduzierbar und kostengünstig. Darüber hinaus sind Funktionsanalysen wie TEER und Permeabilität relativ einfach durchzuführen. Zweidimensionale (2D) Systeme können jedoch die 3D-Natur des In-vivo-Gewebes nicht rekapitulieren, und ihnen fehlen die physiologischen Scherstresskräfte, die durch zirkulierende Blut- und Blutzellen bereitgestellt werden. Dies schränkt die Fähigkeit des vaskulären Endothels in diesen Modellen ein, intrinsische BBB-Eigenschaften und -Funktionen zu entwickeln und zu erhalten.
Mikrotechnische Systeme, die von lebenden Zellen gesäumt sind, wurden implementiert, um verschiedene Organfunktionen in einem Konzept zu modellieren, das Organ-on-Chips genannt wird. Durch die Nachbildung in vivo-ähnlicher multizellulärer Architektur, Gewebe-Gewebe-Schnittstellen, physikalisch-chemischer Mikroumgebungen und vaskulärer Perfusion erzeugen diese mikrotechnischen Plattformen ein Maß an Gewebe- und Organfunktionalität, das mit konventionellen 2D-Kultursystemen. Sie ermöglichen auch hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung und Analyse von biochemischen, genetischen und metabolischen Profilen ähnlich wie lebende Zellen im in vivo Gewebe- und Organkontext. Eine besondere Herausforderung des Organ-on-Chip besteht jedoch darin, dass das Design, die Herstellung und die Anwendung dieser mikrotechnischen Chips spezielles technisches Know-how erfordert, das in biologisch orientierten akademischen Labors normalerweise fehlt.
Wir haben vor kurzem iPSC und Organ-on-Chip-Technologien kombiniert, um ein personalisiertes BBB-Chipmodell15,16zu generieren. Um die beschriebenen technologischen Herausforderungen zu meistern, wird der handelsübliche Chip-S1 zusammen mit dem Kulturmodul verwendet, einem Instrument, das die Wartung der Chips auf einfache und robuste Weise automatisieren soll (Emulate Inc.). Der BBB-Chip erzeugt Wechselwirkungen zwischen neuronalen und endotheliaalen Zellen und erreicht physiologisch relevante TEER-Werte, die durch maßgeschneiderte Organchips mit integrierten Goldelektroden17gemessen werden. Darüber hinaus zeigt der BBB-Chip eine geringe parazelluläre Durchlässigkeit, reagiert auf entzündliche Hinweise auf Organebene, drückt aktive Efflux-Pumpen aus und zeigt einen prädiktiven Transport von löslichen Biomarkern und Biopharmazeutika. Bemerkenswert ist, BBB-Chips von mehreren Personen erzeugt erfasst die erwarteten funktionellen Unterschiede zwischen gesunden Personen und Patienten mit neurologischen Erkrankungen15.
Das unten beschriebene Protokoll beschreibt eine zuverlässige, effiziente und reproduzierbare Methode zur Erzeugung menschlicher iPSC-basierter BBB-Chips unter dynamischen Strömungsbedingungen. Es werden Leitlinien für die Art der Assays und Endpunktanalysen bereitgestellt, die direkt im BBB-Chip oder aus Probenahmeabwässern durchgeführt werden können. So zeigt das Protokoll das Spektrum der Techniken, die zur Bewertung biologischer und funktioneller Eigenschaften und Reaktionen in einem humanrelevanten Modell eingesetzt werden können.
Eine kurze Beschreibung des iPSC-basierten BBB-Chips finden Sie hier. Humane iPSCs werden zunächst in Gewebekulturkolben als frei schwebende Aggregate neuronaler Vorläufer, sogenannteEZ-Kugeln, unterschieden und vermehrt. Der obere Kanal des Chip-S116,18,19 ist mit dissoziierten EZ-Kugeln gesät, die die “Gehirnseite” des Chips bilden, da sich Zellen über 7 Tage in eine gemischte Kultur von neuronalen Vorläuferzellen (iNPCs), iAstrozyten und iNeuronen differenzieren. Humane iPSCs werden auch in Gewebekulturplatten in iBMECs unterschieden. Der untere Kanal des Chips wird mit iBMECs gesät, um die “Blutseite” zu bilden, während sie sich zu einem Endothelrohr entwickeln (Abbildung 1). Die poröse extrazelluläre Matrix (ECM)-beschichtete Membran, die den oberen und unteren Kanal trennt 1) ermöglicht die Bildung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kanälen und 2) ermöglicht es dem Benutzer, Permeabilitätstests und Bildzellen in beiden Kanälen mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop auszuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kombination von Organ-on-Chip-Technologie und iPSC-abgeleiteten Zellen in der NVU verspricht eine genaue Modellierung des menschlichen BBB. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die einfache und robuste Anwendung des kürzlich veröffentlichten iPSC-basierten BBB-Chips16. Eine Übersicht und das Timing des Seeding-Paradigmas sind in Abbildung 3dargestellt. Um Barrierefunktionen zu erhalten und zu erhalten, die für die BBB-Modellierung geeignet sind, is…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Soshana Svendsen für die kritische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Israel Science Foundation Stipendium 1621/18, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST), Israel 3-15647, das California Institute for Regenerative Medicine Grant ID DISC1-08800, die Sherman Family Foundation, NIH-NINDS Grant 1UG3NS105703, und The ALS Association Grant 18-SI-389. Die AH wurde von der Wallenberg Foundation (Fördernummer 2015.0178) gefördert.
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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