Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana
Summary
La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BBB) está formada por unidades neurovasculares (NFI) que protegen el sistema nervioso central (SNC) de una serie de factores que se encuentran en la sangre que pueden alterar la delicada función cerebral. Como tal, el BBB es un obstáculo importante para la entrega de terapias al SNC. La acumulación de evidencia sugiere que el BBB desempeña un papel clave en la aparición y progresión de las enfermedades neurológicas. Por lo tanto, existe una enorme necesidad de un modelo BBB que pueda predecir la penetración de fármacos dirigidos al SNC, así como dilucidar el papel de la BBB en la salud y la enfermedad.
Recientemente hemos combinado tecnologías de células madre pluripotentes (iPSC) de órgano en chip para generar un chip BBB totalmente personalizado para los seres humanos. Esta novedosa plataforma muestra propiedades celulares, moleculares y fisiológicas que son adecuadas para la predicción del transporte de fármacos y moléculas a través de la BBB humana. Además, utilizando chips BBB específicos del paciente, hemos generado modelos de enfermedad neurológica y demostrado el potencial para aplicaciones de medicina predictiva personalizada. Aquí se proporciona un protocolo detallado que demuestra cómo generar chips BBB derivados de iPSC, comenzando con la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC (iBMECs) y dando como resultado cultivos neuronales mixtos que contienen progenitores neuronales, neuronas diferenciadas y astrocitos. También se describe un procedimiento para la sembración de células en el chip del órgano y el cultivo de los chips BBB bajo flujo laminar controlado. Por último, se proporcionan descripciones detalladas de los análisis de chip BBB, incluidos los ensayos de permeabilidad paracelulares para evaluar la permeabilidad de fármacos y moléculas, así como métodos inmunocitoquímicos para determinar la composición de los tipos de células dentro del chip.
Introduction
El BBB es una barrera altamente selectiva que separa el SNC de la sangre circulante. Protege las funciones cerebrales críticas de sustancias, factores y xenobióticos potencialmente disruptivos, al tiempo que permite la afluencia de nutrientes y otros metabolitos necesarios para mantener la homeostasis cerebral1. El BBB es un NVU multicelular en el que los procesos pericitados, los pies de los pies finales de la astrocitos y los neuronales contactan directamente con las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas interacciones permiten a los BMEC formar propiedades de barrera especializadas que son soportadas por cruces apretados y adheridos2,3. La formación de esta barrera limita el paso paracelular de moléculas, pero contiene transportadores polarizados para transportar activamente moléculas al SNC o de vuelta a la sangre1. Debido a estas propiedades únicas de barrera, el BBB constituye un obstáculo importante para la entrega de biofarmacéuticos en el cerebro, y se estima que menos del 5% de las moléculas pequeñas aprobadas por la FDA pueden llegar al SNC4.
Los modelos animales se han utilizado ampliamente para estudiar la penetración bBB y los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de BBB5. Mientras que los modelos animales representan fielmente el complejo entorno multicelular in vivo, las diferencias en la expresión y la actividad de los transportadores BBB, así como la especificidad del sustrato entre especies a menudo impiden la extrapolación precisa de los datos de los animales a los seres humanos6. Por lo tanto, los modelos basados en humanos son críticos para estudiar el BBB humano y para su uso en el desarrollo de fármacos diseñados para atacar el SNC. Esta necesidad se hace aún más evidente con el creciente dominio de los medicamentos biológicos específicos para el ser humano en el campo del desarrollo farmacéutico. La acumulación de evidencia sugiere que un BBB comprometido está asociado con una serie de trastornos graves del SNC, incluyendo tumores cerebrales y enfermedades neurológicas7,8,9. Los modelos humanos que reflejan fielmente estas enfermedades tienen el potencial de identificar dos vías novedosas que podrían ser dirigidas al desarrollo de fármacos y 2) predecir la penetración del SNC, reduciendo así el tiempo y los recursos en los estudios preclínicos y posiblemente disminuyendo la tasa de fracaso en los ensayos clínicos.
Los modelos in vitro se han implementado ampliamente para estudiar las interacciones entre los BMEC y otras células de la NVU y realizar pantallas para posibles fármacos permeables a BBB10. Para recrear aspectos clave del BBB humano, los modelos in vitro deben mostrar propiedades fisiológicamente relevantes (es decir, baja permeabilidad paracelular y resistencia eléctrica transendotelial fisiológicamente relevante [TEER] a través de la monocapa endotelial). Además, el perfil molecular de un sistema in vitro debe incluir la expresión de sistemas de transporte funcional representativos. Típicamente, los modelos in vitro se componen de células endoteliales que se cultivan co-cultivo en una membrana semipermeable con combinaciones de otras células NVU para mejorar las propiedades BBB11. Este enfoque permite una evaluación simple y relativamente rápida de la funcionalidad de barrera y la permeabilidad de las moléculas. Estos modelos BBB basados en células se pueden establecer con fuentes celulares animales o humanas, incluyendo células aisladas de escisiones quirúrgicas o líneas BMEC inmortalizadas.
Recientemente, se introdujeron protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas en BMECs como una fuente atractiva para los modelos BBB humanos in vitro12,13. Los BMEC derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son altamente escalables, demuestran características morfológicas y funcionales cruciales del BBB humano y llevan la genética del paciente. En el cultivo, los iBMEC forman una monocapa que expresa marcadores de unión apretados y muestra complejos de unión estrecha in vivo-como. Estas células también expresan marcadores BBB, incluyendo el transportador de glucosa BBB, transportador de glucosa 1 (GLUT1). Es importante destacar, y a diferencia de otras fuentes celulares alternativas para los MCC humanos, los iBMEC adquieren propiedades de barrera con valores tan altos como los medidos in vivo14,polarizan a lo largo del eje basolateral y expresan bombas de eflujo funcional. Además, el uso de iPSCs de diversas asignaturas tanto 1) acoge con beneplácito la oportunidad de probar aspectos de la BBB de manera personalizada y 2) proporciona una fuente flexible para generar tipos de células adicionales de la NVU. La generación de estas células a partir de una fuente celular isogénica para crear chips BBB personalizados también ayudaría a comprender las diferencias interindividuales en las respuestas a los medicamentos, que es una causa importante de resistencia o respuesta comprometida al tratamiento observado en estudios clínicos.
El uso de iBMECs como monocapas en un plato o en una plaquita transwell semi permeable representa un enfoque potente para el modelado BBB. Estos sistemas tienden a ser robustos, reproducibles y rentables. Además, los análisis funcionales como el TEER y la permeabilidad son relativamente fáciles de realizar. Sin embargo, los sistemas bidimensionales (2D) no recapitulan la naturaleza 3D del tejido in vivo, y carecen de las fuerzas fisiológicas de tensión de cizallamiento proporcionadas por la sangre circulante y las células sanguíneas. Esto limita la capacidad del endotelio vascular en estos modelos para desarrollar y mantener propiedades y funciones intrínsecas de BBB.
Los sistemas microingenieros forrados por células vivas se han implementado para modelar diversas funcionalidades de órganos en un concepto llamado órgano en chip. Al recrear arquitectura multicelular in vivo-como, interfaces tejido-tejido, microambientes fisicoquímicos y perfusión vascular, estas plataformas microingeniería generan niveles de funcionalidad de tejido y órgano sin ser posible con sistemas de cultivo 2D convencionales. También permiten una alta resolución, imágenes en tiempo real y análisis de perfiles bioquímicos, genéticos y metabólicos similares a las células vivas en el contexto del tejido in vivo y los órganos. Sin embargo, un desafío particular del órgano en chip es que el diseño, la fabricación y la aplicación de estos chips microingenieros requieren experiencia especializada en ingeniería que generalmente carece de laboratorios académicos orientados biológicamente.
Recientemente hemos combinado las tecnologías iPSC y organ-on-chip para generar un chip BBB personalizado modelo15,16. Con el fin de superar los desafíos tecnológicos descritos, el Chip-S1 disponible comercialmente se utiliza junto con el módulo de cultivo, un instrumento diseñado para automatizar el mantenimiento de los chips de una manera simple y robusta (Emulate Inc.). El chip BBB recrea interacciones entre células neuronales y endoteliales y logra valores TEER fisiológicamente relevantes, que se miden mediante chips de órgano hechos a medida con electrodos de oro integrados17. Además, el chip BBB muestra baja permeabilidad paracelular, responde a señales inflamatorias a nivel de órganos, expresa bombas de eflujo activo y exhibe transporte predictivo de biomarcadores solubles y biofarmacéuticos. En particular, los chips BBB generados a partir de varios individuos capturan las diferencias funcionales esperadas entre individuos sanos y pacientes con enfermedades neurológicas15.
El protocolo detallado a continuación describe un método confiable, eficiente y reproducible para la generación de chips BBB basados en iPSC humanos en condiciones de flujo dinámico. Se proporciona orientación sobre el tipo de ensayos y análisis de punto final que se pueden realizar directamente en el chip BBB o a partir de efluentes de muestreo. Por lo tanto, el protocolo demuestra el espectro de técnicas que se pueden aplicar para evaluar las propiedades y respuestas biológicas y funcionales en un modelo relevante para el ser humano.
Aquí se proporciona una breve descripción del chip BBB basado en iPSC. Los iPSC humanos se diferencian y propagan inicialmente en matraces de cultivo de tejidos como agregados flotantes libres de progenitores neuronales, llamados esferas EZ. El canal superior del Chip-S116,18,19 está sembrado con esferras EZ disociadas que forman el “lado cerebral” del chip, ya que las células se diferencian durante 7 días en un cultivo mixto de células progenitoras neuronales (iNCAP), iAstrocytes e iNeurons. Los iPSC humanos también se diferencian en placas de cultivo de tejidos en iBMECs. El canal inferior del chip se sembra con iBMECs para formar el “lado de la sangre” a medida que se desarrollan para formar un tubo endotelial (Figura 1). La membrana recubierta de matriz extracelular porosa (ECM) que separa los canales superior e inferior 1) permite la formación de interacciones de célula a célula entre los canales y 2) permite al usuario ejecutar ensayos de permeabilidad y células de imagen en cualquiera de los canales utilizando un microscopio de luz convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
La combinación de la tecnología de órgano en chip y las células derivadas de iPSC en la NVU es prometedora para el modelado preciso del BBB humano. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la aplicación simple y robusta del chip BBB16basado recientemente en iPSC. En la Figura 3se muestra una descripción general y una sincronización del paradigma de sembración. Para obtener y mantener funciones de barrera adecuadas para el modelado BBB, es fundamental …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Soshana Svendsen por su edición crítica. Este trabajo fue apoyado por la beca 1621/18 de la Fundación De ciencia de Israel, el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST), Israel 3-15647, la subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California ID DISC1-08800, la Fundación de la Familia Sherman, la concesión NIH-NINDS 1UG3NS105703, y la subvención de la Asociación de ALS 18-SI-389. AH fue financiado por la Fundación Wallenberg (número de subvención 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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