Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Summary

Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.

Abstract

Comprender la regulación a nivel celular y tisular del crecimiento y la morfogénesis ha estado a la vanguardia de la investigación biológica durante muchas décadas. Los avances en tecnologías moleculares y de imagen nos permitieron obtener información sobre cómo las señales bioquímicas influyen en los eventos morfogenéticos. Sin embargo, es cada vez más evidente que aparte de las señales bioquímicas, las señales mecánicas también afectan a varios aspectos del crecimiento celular y tisular. El arabidopsis shoot apical meristem (SAM) es una estructura en forma de cúpula responsable de la generación de todos los órganos sobre el suelo. La organización del citoesqueleto de microtúbulo cortical que media la deposición de celulosa apoplástica en las células vegetales es espacialmente distinta. La visualización y evaluación cuantitativa de patrones de microtúbulos corticales son necesarias para comprender la naturaleza biofísica de las células en el SAM, ya que la celulosa es el componente más rígido de la pared celular de la planta. La forma estereotipada de la organización de microtúbulos corticales también es una consecuencia de las fuerzas físicas de todo el tejido existentes en el SAM. La perturbación de estas fuerzas físicas y el posterior seguimiento de la organización de microtúbulos corticales permite la identificación de proteínas candidatas implicadas en la mediación de la mecano-percepción y transducción. Aquí describimos un protocolo que ayuda a investigar tales procesos.

Introduction

Las células vegetales están rodeadas por una matriz extracelular de polisacáridos y glicoproteínas que se asemeja mecánicamente a un material compuesto reforzado con fibra capaz de cambiar dinámicamente sus propiedades mecánicas^1. El crecimiento de las células vegetales es impulsado por la absorción de agua en la célula, lo que resulta en una acumulación concomitante de fuerzas de tracción en la pared celular. En respuesta a tales fuerzas, las modificaciones en el estado físico de la pared celular permiten la expansión de la célula. Las células con paredes primarias son capaces de experimentar un crecimiento rápido en comparación con la pared celular secundaria que contiene células principalmente debido a las diferencias en la composición química de los polisacáridos en su interior. Las células de la pared primaria se componen de celulosa, hemicelulosa y pectina además de glicoproteínas, y carecen de lignina, un componente que está presente en la pared celular secundaria^2. La celulosa, un polímero de glucosa unido a través de enlaces β-1,4, es el componente principal de las paredes celulares. Se organiza en estructuras fibrilares que son capaces de soportar las fuerzas de alta tracción experimentadas durante el crecimiento celular^3. Además de soportar las fuerzas de tracción, el refuerzo mecánico a lo largo de una dirección preferencial da como resultado una expansión impulsada por el turgor a lo largo de un eje perpendicular a la orientación neta de la microfibrilla de celulosa. La organización de las microfibrillas de celulosa está influenciada por el citoesqueleto de microtúbulo cortical, ya que guían el movimiento direccional de los complejos de celulosa-sintetización situados en la membrana plasmática⁴. Por lo tanto, el monitoreo de la organización de microtúbulos corticales utilizando una proteína o tubulina asociada a microtúbulos fusionada con una molécula fluorescente sirve como un proxy para la observación de patrones excesivos de celulosa en las células vegetales.

El patrón del citoesqueleto de microtúbulo cortical está bajo el control de las fuerzas mecánicas derivadas de la morfología celular y tisular. La organización de microtúbulos corticales no tiene ninguna organización preferencial a lo largo del tiempo en las células situadas en el ápice del SAM, mientras que las células de la periferia y el límite entre el SAM y el órgano emergente tienen una matriz supracelular estable y altamente organizada de microtúbulos corticales⁵. Se han desarrollado varios enfoques para perturbar físicamente el estado mecánico de las células. Los cambios en el estado osmótico, así como el tratamiento con compuestos farmacológicos y enzimáticos que influyen en la rigidez de la pared celular pueden dar lugar a cambios posteriores en las fuerzas de tracción experimentadas por la célula^6,7. El uso de artilugios que permitan el aumento gradual de las fuerzas de compresión experimentadas por los tejidos es otra alternativa^8. También se ha demostrado que la aplicación de fuerzas centrífugas influye en las fuerzas mecánicas sin ningún contacto físico con las células^9. Sin embargo, los medios más utilizados para cambiar las fuerzas direccionales en un grupo de células aprovechan el hecho de que todas las células epidérmicas están bajo tensión y la ablación física de las células eliminará la presión del turgor localmente, así como la alteración de la adhesión de célula a célula, modificando así las fuerzas de tracción experimentadas por las células vecinas. Esto se realiza ya sea apuntando a un láser ultravioleta pulsado de alta potencia o por medio de una aguja fina.

Aquí profundizamos en el proceso de toma de imágenes y evaluación del comportamiento de los microtúbulos corticales para la perturbación mecánica en el SAM.

Protocol

1. Crecimiento de la planta Cerda semillas de Arabidopsis que expresan el dominio de unión a microtúbulos fusionado con proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 en el suelo y mantener en largo día (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/6 oC durante 1 semana para la germinación. Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto. Mantener las plantas en d…

Representative Results

La Figura 1 muestra imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas MBD-GFP con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, y celdas en la periferia que tienen una distribución circunferencial (Figura 1A,B), mientras que las celdas de dominio de límite contienen microtúbulos corticales alineados paralelos al eje largo de la célula. Estas observaciones muestr…

Discussion

La evaluación de los eventos de transducción de señales mecánicas es crucial para identificar los reguladores moleculares involucrados en las vías de mecanoso-percepción y transducción. El protocolo descrito aquí proporciona una visión cuantitativa de tales eventos utilizando la respuesta de microtúbulo cortical como lectura para dicho proceso en los SAM de Arabidopsis. El procedimiento descrito aquí se utiliza habitualmente en varios estudios en diversos tipos de tejidos¹⁶<sup…

Materials

FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625