We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.
Proteomische technologieën zijn krachtige methoden die ons begrip van de werkingsmechanismen in biologische systemen kunnen helpen door een globaal beeld te geven van de impact van een ziekte, behandeling of andere aandoening op het proteoom als geheel. Dit rapport bevat een gedetailleerd protocol voor de extractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering en daaropvolgende gegevensanalyse van eiwitmonsters. Ons geoptimaliseerde TMT-labelingprotocol vereist een lagere tag-labelconcentratie en bereikt consistent betrouwbare gegevens. We hebben dit protocol gebruikt om eiwitexpressieprofielen te evalueren in een verscheidenheid aan muisweefsels (d.w.z. hart, skeletspieren en hersenen) en cellen gekweekt in vitro. Daarnaast laten we zien hoe we duizenden eiwitten uit de resulterende dataset kunnen evalueren.
De term “proteomics” werd voor het eerst gedefinieerd als de grootschalige karakterisering van de gehele eiwitaanvulling van een cel, weefsel of organisme1. Proteomische analyses maken het mogelijk mechanismen en cellulaire processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, therapeutische trajecten en gezonde systemen met behulp van technieken om relatieve kwantificering van eiwitexpressie niveaus uit te voeren2. De eerste beschrijvingen van dergelijke studies werden gepubliceerd in 1975 en toonden het gebruik van tweedimensionale polyacrylamide gel elektroforese (2D-PAGE) voor dit doel1,3. De 2D-methode scheidt eiwitten op basis van lading (isoelectrische scherpstelling, IEF) en moleculaire massa (natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese, of SDS-PAGE)4. Jarenlang was de combinatie van 2D-PAGE en de daaropvolgende tandemmassaspectrometrie op elke gelcomponent de meest voorkomende ongerichte eiwitexpressieanalysetechniek die werd uitgevoerd en identificeerde talrijke voorheen onbekende eiwitexpressieprofielen5,6. Algemene nadelen van de 2D-PAGE benadering zijn dat het tijdrovend is, niet goed werkt voor hydrofobe eiwitten, en er zijn beperkingen in het totale aantal eiwitten beoordeeld als gevolg van lage gevoeligheid7,8.
De stabiele isotoop etikettering door aminozuren in de celcultuur (SILAC) methode werd de volgende populaire aanpak te identificeren en kwantificeren eiwit overvloed in monsters9. Het bestaat uit metabolische etikettering van cellen die zijn geïncubeerd in medium ontbreekt een standaard essentieel aminozuur en aangevuld met een isotoop-gelabelde versie van dat specifieke aminozuur10. Het voordeel van deze techniek is de efficiëntie en nauwkeurige etikettering9. De belangrijkste beperking van de SILAC-benadering is in de eerste plaats de verminderde celgroei die wordt veroorzaakt door de integratie van isotopenlabels, wat bijzonder uitdagend kan zijn in relatief gevoelige cellijnen die menselijke ziekten modelleren11.
In 2003 werd een nieuwe en robuuste proteomics techniek met tandem mass tag (TMT) isobaric labels geïntroduceerd op het veld12. TMT-etikettering is een krachtige methode vanwege de verhoogde gevoeligheid voor het detecteren van relatieve eiwitexpressieniveaus en posttranslationele modificaties13. Vanaf deze publicatiedatum zijn TMT-kits ontwikkeld die tegelijkertijd 6, 10, 11 of 16 monsters kunnen labelen. Als gevolg hiervan is het mogelijk om peptide overvloed te meten in meerdere omstandigheden met biologische repliceert op hetzelfde moment14,15,16. We hebben onlangs TMT gebruikt om het cardiale proteomische profiel van een muismodel van Barth Syndroom (BTHS)17te karakteriseren. Daarbij konden we een wijdverbreide verbetering van de hartprofielen van BTHS-muizen die met gentherapie werden behandeld, aantonen en nieuwe eiwitten identificeren die werden beïnvloed door BTHS, die nieuwe therapeutische paden onthulden die betrokken waren bij cardiomyopathieën.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om multiplex TMT kwantitatieve proteomics analyses uit te voeren met behulp van weefselmonsters of celpellets. Het kan nuttig zijn om de monstervoorbereiding en etikettering uit te voeren voordat ze aan een kern worden ingediend, omdat de gelabelde tryptische peptiden stabieler zijn dan ruwe bevroren monsters, niet alle kernen hebben ervaring met het hanteren van alle monstertypen, en het voorbereiden van monsters in een laboratorium kan tijd besparen voor kernen, die vaak lange achterstanden hebben. Voor gedetailleerde beschrijvingen van het massaspectroscopiegedeelte van dit proces raadpleegt u Kirshenbaum et al. en Perumal et al.18,19.
Het monsterpreparaat bestaat uit de volgende belangrijke stappen: extractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering en etikettering. De belangrijkste voordelen van dit geoptimaliseerde protocol zijn dat het de kosten van etikettering verlaagt, de eiwitextractie verbetert en consequent gegevens van hoge kwaliteit genereert. Daarnaast beschrijven we hoe we TMT-gegevens kunnen analyseren om duizenden eiwitten in korte tijd te screenen. We hopen dat dit protocol andere onderzoeksgroepen aanmoedigt om te overwegen deze krachtige methodologie in hun studies op te nemen.
Om monsters met succes voor te bereiden op proteomische analyse met behulp van isobarische isobarische isobarische isotopenealkeuringsmethoden op basis van TMT, is het van cruciaal belang om eiwitextracties zeer zorgvuldig uit te voeren bij 4 °C en een lysebuffer te gebruiken die een proteaseremmercocktail24,25bevat . De protease inhibitor cocktail is een cruciaal reagens om onverwachte eiwitafbraak tijdens eiwitvertering te voorkomen. Een belangrijk verschil tussen ons protocol en het huidige protocol van de leverancier is dat we het gebruik van CHAPS lyse buffer sterk aanbevelen op basis van onze ervaring met zoogdiercellen en weefsels. We raden ook aan om een methanol/chloroforme eiwitneerslagbenadering te gebruiken voor zowel celpellets als weefsels.
Idealiter worden eiwitextractie, meting, vermindering/alkylating reagensbehandelingen en methanol/chloroforme neerslag allemaal op dezelfde dag uitgevoerd. Na deze aanbeveling zal resulteren in nauwkeurigere eiwitconcentraties voor latere etikettering. De eiwitnecipitatiestap is belangrijk voor het verwijderen van reagentia die de tandemmassaspectrometrie verstoren. Inclusief de neerslagstap verbetert de resolutie van TMT26aanzienlijk. Kortom, de belangrijkste voordelen van ons TMT-protocol zijn de hoge etiketteringsefficiëntie voor verschillende soorten monsters, de reproduceerbaarheid en de betrouwbare verkregen gegevens.
Aangezien de multiplex aard van deze TMT ongerichte proteomics strategie blijft uitbreiden, zal het geleidelijk verbeteren van het vermogen van onderzoekers over een breed scala van gebieden om nieuwe ontdekkingen te doen. Specifiek op biomedisch gebied, hebben wij en anderen deze technologie steeds informatiever gevonden in studies die nieuwe werkingsmechanismen in ziekte en relatieve effecten van diverse therapeutica onderzoeken. Om al deze redenen vormt deze krachtige technologie een aanvulling op het repertoire van andere OMICS-benaderingen die in moderne onderzoeken worden gebruikt en biedt belangrijke informatie die verdere therapeutische ontwikkeling kan sturen.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de UF-ICBR proteomics faciliteit voor hun verwerking van onze monsters te erkennen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |