该协议描述了一种在体内的噬菌体测定法,用于评估和量化年轻和老年果蝇黑色素血细胞对噬菌体的能力。
噬菌体是先天免疫反应的一种基本功能。这个过程由噬菌体血细胞进行,其主要功能是识别各种颗粒并破坏微生物病原体。随着生物体的老化,这个过程开始衰退,然而对免疫敏感性的基本机制或遗传基础知之甚少。在这里,一种基于体内邻苯二甲酸酯测定的注射,通过量化成人血Drosophilamelanogaster 细胞中的噬菌体事件,用于评估邻代细胞病不同方面的年龄相关变化,如内化粒子的结合、吞没和降解。其一,先天免疫反应的许多遗传成分和功能,包括咽喉病,在果蝇和哺乳动物之间被进化保护。因此,使用这种协议获得的结果可能与了解不同生物体免疫功能的年龄相关变化有着广泛的相关性。此外,我们注意到,这种方法提供血细胞噬菌体能力的定量估计,可用于各种研究课题,无需局限于衰老研究。
先天免疫系统,由感染的物理和化学屏障以及细胞成分组成,在多细胞生物体1、22之间被进化保护。作为第一道防线,先天免疫系统在防治所有动物11、2、32,3的病原体方面起着至关重要的作用。先天免疫反应的成分包括广泛的细胞类型,分类的基础上,他们缺乏特异性和免疫记忆22,3,4。3,4在人类中,这些细胞类型包括噬菌体单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞和细胞毒性天然杀伤细胞44、5。5虽然拥有功能性免疫系统对宿主生存至关重要,但很明显,免疫细胞的功能会随着年龄的增长而下降,这种现象被称为免疫敏感性55、6。6能够评估免疫反应的年龄相关变化,包括噬菌体过程的不同方面,有助于我们理解免疫敏感性。我们在这里描述的程序提供了一种有效和可重复的方法,以评估和量化血细胞在果蝇黑色素气仪的噬菌体事件。
果蝇是研究免疫反应的理想模型,原因有很多。首先,有一套广泛的遗传工具可用,使很容易操作基因表达在组织依赖的方式7。这些工具包括突变体的集合,RNA干扰种群,GAL4/UAS种群,以及含有205条不同近亲繁殖系的果蝇遗传参考面板,其中整个基因组序列被编目8。果蝇的短生命周期和大量个体的产生使研究人员能够在短时间内在受控环境中测试多个个体。这大大提高了识别基因型、性别之间或不同年龄之间对感染的免疫反应的细微差异的能力。重要的是,许多遗传成分和功能的先天免疫反应,包括噬菌体,在果蝇和哺乳动物11,22之间的进化保护。
在果蝇,感染后产生病菌的过程是由称为血浆细胞的噬菌体血细胞进行的,这相当于哺乳动物巨噬细胞9。细胞对识别各种粒子和清除,微生物病原体9、10、11、12、1310,11至关重要。12,139这些细胞表达各种受体,必须区分自我和非自我,并启动信号事件需要执行噬菌体过程10,11,12,13,14,15。10,11,12,13,14,15一旦粒子被结合,它开始内化通过重组细胞骨架和改造等离子膜,以围绕粒子展开,形成一个噬菌杯11,12,13,14。11,12,13,14在这个过程中,另一组信号告诉细胞通过关闭噬菌杯进一步内化粒子,形成膜结合的邻形体11,12,13,14,15。11,12,13,14,15然后,邻苯二甲酸菌经历了一个成熟过程,与不同的蛋白质结合,并与同体细胞融合,形成酸性邻苯二甲酸的11、12、13、14、15。11,12,13,14,15此时,粒子可以有效地降解和消除11,12,13,14,15。11,12,13,14,15果蝇研究表明,与幼蝇(1周大)相比,较老苍蝇(4周大)清除感染的能力降低,至少部分原因可能是16、17,17岁的咽喉炎的某些方面下降。
此处描述的方法使用两个独立的荧光标记热杀大肠杆菌颗粒,一个带有标准荧光磷和一个pH敏感,以评估噬菌体细胞学的两个不同方面:粒子的初始吞没,以及邻肠胶质颗粒的降解。在此测定中,当颗粒被细胞束缚和吞没时,荧光粒子荧光是可观察到的,而pH敏感颗粒仅在噬菌体的低pH条件下荧光。然后,可以在沿背容器局部的细胞细胞中观察到荧光事件。我们专注于定位到背血管的细胞,它提供了一个解剖学上的里程碑,以定位已知有助于细菌清除的细胞,并持续隔离它们。然而,身体其他部位和淋巴的细胞对清除也很重要。虽然我们还没有研究这种细胞群,我们的一般程序也可以适用于这些细胞的噬菌体测定。我们方法的一个优点是,我们可以量化单个血细胞中的噬菌体事件,使我们能够检测噬菌体过程中的细微变化。其他通过角质18、19,19来可视化荧光事件的研究没有考虑到目前存在的细胞数量的差异,这一点在我们的例子中尤为重要,因为总的细胞计数预计将随着17岁的变化而变化。
此处描述的协议是在受控实验条件下量化噬菌体不同方面的可靠方法。我们注意到,我们只测试了这个程序与克阴性细菌颗粒和结果可能不同,如果使用克阳性细菌颗粒。事实上,将邻形细胞反应与克阴性和克阳性细菌在不同实验条件下进行比较会很有趣。使用纳米喷射器可以精确控制喷射量,确保每只苍蝇都注入相同体积的颗粒。协议的一个限制来自粒子制剂的不一致。粒子一旦冻结就会聚集,因此稀释体积的微小变化或缺乏涡流会影响实验之间的颗粒浓度。为了尽量减少不同年龄之间颗粒浓度的可能变化,使用相同的针头和颗粒溶液在同一天注射1周和5周大苍蝇是有益的。另一个潜在的缺点是,在解剖过程中,如果针脚处理不当,背船和/或角质体很容易被损坏。为避免干扰背船,请尽量减少每次解剖使用的针脚数量。这种解剖方法的优点是,所有固定、洗涤和染色步骤都可以在解剖板上执行。由于角质被固定下来,这可以防止角质在步骤之间丢失。
与现有方法18、19、25、26、27、28、29相比,所述协议有其优点和局限性。18,19,25,26,27,28,29通过解剖背血管,我们能够在此位置可视化和量化单个细胞。这使得可以检测实验组之间的邻形活动中的细微变化。其他方法通过收集血细胞/碎片测定1919,25,26,27,或通过完整的心室角,25,26,271818,19,28,29收集荧光标记粒子;,19,28,29然而,当通过背角质层可视化时,不能评估单个细胞。与出血/刮伤方法相比,该协议的优点是,我们的方法允许我们只评估与背血管相关的血细胞,并解释循环细胞或沿体壁的细胞,这在功能上可能不同。解剖背底容器也消除了包括第二轮注射与荧光淬火剂的需要,如Trypan蓝色19,26。19,这是因为任何不与细胞结合或被细胞吞没的颗粒在洗涤步骤中被冲走。相反,替代方法可能更容易执行,因为它们不需要解剖。虽然解剖背船很容易学习,但此步骤增加了一定程度的复杂性,在某些实验设计中可能并不可行。
虽然这种在体内的邻带性测定的描述是评估和量化不同年龄之间的噬菌体事件,但该协议具有很强的适应性,可用于分析基因型、性别或组织类型之间的噬菌体病的不同方面。由于噬菌体是大多数多细胞动物的中心重要性,了解这一过程如何随着年龄的增长而下降,可以导致对老龄化人群更好的治疗。这种方法为阐明免疫反应中与年龄相关变化的各个方面提供了长期潜力,并特别关注噬菌体。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院R03 AG061484-02和UMBC自然和数学科学学院Becton Dickinson教师研究基金的资助。
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |