एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग कर इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी विकास के खिलाफ रासायनिक अवरोधक दक्षता का निर्धारण
Summary
यहां प्रस्तुत एक कालोसिफेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग करटोक्सोप्लाज्मा गोंडी के इन विट्रो इंट्रासेलर विकास के खिलाफ रासायनिक यौगिकों के अवरोध प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। तकनीक का उपयोग संबंधित लक्ष्य जीन के आनुवंशिक विलोपन द्वारा अवरोध विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। टीजीसीपीएल प्रोटीज़ के खिलाफ एलएचवीएस के अवरोध का मूल्यांकन एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।
Abstract
टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी एक प्रोटोज़ोन रोगजनक है जो व्यापक रूप से मानव आबादी को प्रभावित करता है। नैदानिक टॉक्सोप्लास्मोसिस के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली वर्तमान एंटीबायोटिक्स सीमित हैं। इसके अलावा, वे लोगों के कुछ समूहों में प्रतिकूल दुष्प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, नैदानिक टॉक्सोप्लास्मोसिस के लिए उपन्यास चिकित्सा की खोज जरूरी है। उपन्यास एंटीबायोटिक विकास का पहला कदम उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग करपरजीवी विकास के अवरोध में उच्च प्रभावकारिता दिखाने वाले रासायनिक यौगिकों की पहचान करना है। एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक के रूप में, टॉक्सोप्लाज्मा केवल मेजबान कोशिकाओं के भीतर दोहराने कर सकता है, जो विकास के त्वरित संकेतक के रूप में ऑप्टिकल अवशोषण माप के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। यहां प्रस्तुत एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । एक उदाहरण के रूप में, इस विधि का उपयोग परजीवी इंट्रासेलर विकास के अवरोध के बारे में जंगली प्रकार के टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी के दोहरीकरण समय की गणना करने और मॉर्फोलिनुरिया-ल्यूसिल-होमोफिनाइल-विनाइल सल्फोन फिनाइल (एलएचवीएस, एक साइस्टीन प्रोटीज-लक्ष्यीकरण यौगिक) की प्रभावकारिता को मापने के लिए किया जाता है। यह भी वर्णित है, एक CRISPR-Cas9 आधारित जीन हटाने प्रोटोकॉल है Toxoplasma में ५० बीपी के मुताबिक़ क्षेत्रों का उपयोग कर homology पर निर्भर पुनर्संयोजन (HDR) के लिए । जंगली प्रकार और टीजीसीपीएल (टॉक्सोप्लास्मा कैथेप्सिन एल-लाइक प्रोटीज़) में एलएचवीएस के अवरोध की मात्रा निर्धारित करके, यह दिखाया गया है कि एलएचवीएस Δcpl जंगली प्रकार के परजीवी विकास को अधिक कुशलता से रोकता है, यह सुझाव देता है कि टीजीपीएल एक लक्ष्य है जिसे एलएचवीएस टॉक्सोप्लास्मामें बांधता है। इस लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख की उच्च संवेदनशीलता और आसान संचालन इसे टॉक्सोप्लाज्म्स्मा प्रसार की निगरानी और उच्च थ्रूपुट तरीके से दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त बनाता है।
Introduction
टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी एक बेहद सफल अनिवार्य इंट्रासेलर परजीवी है जो मानव आबादी के लगभग एक तिहाई को संक्रमित करता है। इसकी उच्च पारेषण दर मुख्य रूप से संचरण के अपने विविध मार्गों के कारण है, जिसमें अधपका मांस की खपत, स्तनधारी जलाशयों के संपर्क में आना और जन्म के दौरान जन्मजात संचरण शामिल है । टी गोंदी मुख्य रूप से अवसरवादी संक्रमण का कारण बनता है जो,इम्यूनोसमझौताव्यक्तियों1, 2,23,,4,,5,,6में गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर का कारण बन सकता है । वर्तमान में तीव्र टॉक्सोप्लास्मोसिस के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबायोटिकदवाएं विशेष रूप से जन्मजात और अव्यक्त संक्रमणों के इलाज में अक्षम होती हैं और कुछव्यक्तियों3,7,8में गंभीर प्रतिक्रियाएं पैदा करती हैं । इस प्रकार, उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता मौजूद है। टॉक्सोप्लाज्मा और इसके मेजबान के भीतर उपकोशिकीय प्रक्रियाओं में अंतर को समझना संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने में मदद करेगा। इसलिए, टॉक्सोप्लाज्माके भीतर व्यक्तिगत जीन की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल और सुविधाजनक जीनोम हेरफेर तकनीकों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, टॉक्सोप्लाज्मा फिलम एपिकॉम्प्लेक्सा से संबंधित है, जिसमें प्लाज्मोडियम एसपीपी और क्रिप्टोस्पोरिडियम एसपीपी जैसे कई अन्य महत्वपूर्ण मानव रोगजनक शामिल हैं। इसलिए, टॉक्सोप्लाज्मा का उपयोग अन्य एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी में बुनियादी जीव विज्ञान का अध्ययन करने में मदद करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में किया जा सकता है।
माइक्रोबियल रोगजनकों के खिलाफ उपन्यास एंटीबायोटिक दवाओं की पहचान करने के लिए, रासायनिक यौगिकों की एक पुस्तकालय की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग शुरू में माइक्रोबियल विकास के दमन में उनकी प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए की जाती है। अब तक टी के इंट्रासेलर ग्रोथ को मापने के लिए माइक्रोप्लेट बेस्ड ग्रोथ परख ें तैयार की गई Toxoplasma हैं । गोंदी (यानी, रेडियोधर्मी 3एच-उरसिल इनकॉरपोरेशन-आधारित क्वांटिफिकेशन9,मात्रात्मक एलिसा आधारित परजीवी टी गोंडी-विशिष्टएंटीबॉडी10,,11,रिपोर्टर प्रोटीन-आधारित माप का उपयोग करके12,,13,और हाल ही में विकसित उच्च सामग्री इमेजिंग assay14)।
इन व्यक्तिगत रणनीतियों सभी अद्वितीय लाभ है; हालांकि, कुछ सीमाएं उनके अनुप्रयोगों को भी प्रतिबंधित करती हैं। उदाहरण के लिए, चूंकि टॉक्सोप्लाज्मा केवल न्यूक्लेट पशु कोशिकाओं, ऑटोफ्लोरेसेंस औरएंटी-टी गोंदीई एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के भीतर दोहराने के लिए कोशिकाओं की मेजबानी कर सकता है। इसके अलावा, रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग के लिए विशेष सुरक्षा अनुपालन और संभावित सुरक्षा मुद्दों की आवश्यकता होती है। इनमें से कुछ परख विकास की सतत निगरानी के बजाय एक ही समय बिंदु पर विकास का आकलन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।
यहां प्रस्तुत इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास की मात्रा के लिए एक ल्यूसिफ़ेरेबेस आधारित प्रोटोकॉल है। पिछले अध्ययन में, नैनोल्यूक ल्यूसिफ़ेरेज जीन को टॉक्सोप्लाज्मा ट्यूबलिन प्रमोटर के तहत क्लोन किया गया था, और इस लूसिफ़ेरेज़ अभिव्यक्ति निर्माण को जंगली प्रकार (RHΤku80hxg तनाव) परजीवी में स्थानांतरित किया गया था ताकि एक RH1kuku80hxgबनाया जा सके::NLuc तनाव (RHΤku80के रूप में संदर्भित:NLuc इसके बाद)15.ku80 इस तनाव ने इस अध्ययन में इंट्रासेलुलर विकास निर्धारण और जीन विलोपन के लिए माता-पिता के तनाव के रूप में कार्य किया । RHΤku80का उपयोग करना::NLuc तनाव, मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफएफ) में परजीवी वृद्धि परजीवी दोहरीकरण समय की गणना करने के लिए संक्रमण के बाद 96 घंटे की अवधि में निगरानी की गई थी।
इसके अलावा, परजीवी विकास के खिलाफ एलएचवीएस की अवरोध प्रभावकारिता आईसी50 मूल्य की पहचान करने के लिए धारावाहिक एलएचवीएस सांद्रता के खिलाफ टॉक्सोप्लाज्मा विकास दर की साजिश रचकर निर्धारित की जा सकती है। पिछले साहित्य ने बताया है कि टीजीसीपीएल परजीवी में एलएचवीएस का एक प्रमुख लक्ष्य है और एलएचवीएस के साथ उपचार तीव्र और पुरानी टॉक्सोप्लाज्मा संक्रमण16, 17,1818,19के विकास को कम करता है ।, इसके अतिरिक्त, RHΤku80::NLuc जीनोम संशोधन के लिए माता पिता के तनाव के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक TgCPL-कमीतनाव (RHΤku80Cpl::NLuc),और LHVS के अवरोध इस उत्परिवर्ती के खिलाफ मापा गया था । टीजीपीएलमें एलएचवीएस के लिए आईसी50 मूल्यों के एक अपशिफ्ट को देखकर डब्ल्यूटी तनाव की तुलना में कमी परजीवी, यह मान्य किया गया था कि टीजीपीएल को वीवो में एलएचवीएस द्वारा लक्षित किया गया है।
इस प्रोटोकॉल में, RHΤku80::NLuc माता पिता के तनाव के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो एक कुशल गैर-समरूप अंत में शामिल होने के मार्ग (NHEJ) का अभाव है, जिससे डबल क्रॉसओवर होमोलॉजी-निर्भर पुनर्संयोजन (एचडीआर)20,,21की सुविधा होती है। इसके अतिरिक्त, पीसीआर द्वारा दवा प्रतिरोध कैसेट के दोनों सिरों पर 50 बीपी के मुताबिक़ क्षेत्र ों को फ्लैंक किया जाता है। पीसीआर उत्पाद CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन उपकरणों का उपयोग करके एचडीआर के माध्यम से पूरे जीन लोकस को हटाने के लिए एक मरम्मत टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। इस तरह के छोटे मुताबिक़ क्षेत्रों को आसानी से प्राइमर में शामिल किया जा सकता है, जो मरम्मत टेम्पलेट के उत्पादन के लिए एक सुविधाजनक रणनीति प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को सार्वभौमिक जीन विलोपन और एंडोजेनस जीन टैगिंग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
उदाहरण के लिए, हमारे सबसे हालिया प्रकाशन में, तीन प्रोटीज़ जीन, टीजीसीपीएल, टीजीसीपीबी (टॉक्सोप्लाज्मा कैथेप्सिन बी-जैसे प्रोटीज), और TgSUB1 (टॉक्सोप्लाज्मा सबटिलाइजिन की तरह प्रोटीज 1), इस विधिकाउपयोग करके टीजीसीआरटी (टॉक्सोप्लाज्मा क्लोरोक्वीन-रेजिस्टेंस ट्रांसपोर्टर) – कमी परजीवी में आनुवंशिक रूप से पकड़े गए थे। इसके अतिरिक्त, TgAMN (एक ख्यात aminopeptidase एन [TgAMN, TGGT1_221310]) एंडोजेन्सियस15टैग किया गया था । लोरीडो लैब ने साइट-निर्देशित जीन उत्परिवर्तन और टॉक्सोप्लाज्मा जीनोम में एंडोजेनस जीन टैगिंग की शुरुआत के लिए 40-4322बीपी की सीमा में छोटे मुताबिक़ क्षेत्रों का उपयोग करने की भी सूचना दी। इन सफल जीनोम संशोधनों से पता चलता है कि टीजीकेयू80-कमीवाले तनाव में कुशल डीएनए पुनर्संयोजन के लिए 40-50 बीपी के रूप में सभी क्षेत्र पर्याप्त हैं, जो टॉक्सोप्लाज्मा गोंडीमें जीनोम हेरफेर को बहुत सरल बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
++यह प्रोटोकॉल इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास का आकलन करने और परजीवी विकास के खिलाफ रासायनिक यौगिकों की अवरोध प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक लूसिफ़ेरेज़-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करत…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT प्लाज्मिड और एंटी-टीजीसीपीएल और टीजीएक्टिवन एंटीबॉडी साझा करने के लिए डीआरएस सिबली और कैरूथर्स का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को क्लेमसन स्टार्टअप फंड (जेडडी) द्वारा समर्थित किया गया था, शूरवीर टमप्लर आई फाउंडेशन पीडियाट्रिक नेत्र विज्ञान कैरियर-स्टार्टर रिसर्च ग्रांट (जेड डी को), एक एनआईएच COBRE अनुदान P20GM109094 (जेड डी के लिए) का प्रायोगिक अनुदान, और NIH R01AI143707 (जेड डी के लिए)। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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