Определение эффективности химического ингибитора против внутриклеточного токсоплазмы Gondii Рост С помощью Люциферазы основе анализ роста
Summary
Представлен протокол для оценки эффективности ингибирования химических соединений против интраклеточного роста Toxoplasma gondii с использованием анализа роста на основе люциферазы. Метод используется для подтверждения специфики ингибирования путем генетического удаления соответствующего гена-мишени. В качестве примера оценивается ингибирование LHVS против протеазы TgCPL.
Abstract
Toxoplasma gondii является протозоанным патогеном, который широко влияет на популяцию человека. Текущие антибиотики, используемые для лечения клинического токсоплазмоза ограничены. Кроме того, они проявляют неблагоприятные побочные эффекты в определенных группах людей. Поэтому, открытие новых терапевтических препаратов для клинического токсоплазмоза является обязательным. Первым шагом развития новых антибиотиков является выявление химических соединений, показывающих высокую эффективность ингибирования роста паразитов с использованием высокой пропускной технологии стратегии скрининга. Как обязывательный внутриклеточный патоген, Токсоплазма может размножаться только в клетках-хозяинах, что запрещает использование оптических измерений абсорбции в качестве быстрого индикатора роста. Представлено здесь подробный протокол для luciferase основе роста асссе. В качестве примера, этот метод используется для расчета удвоения времени дикого типа паразитов токсоплазмы и измерения эффективности морфолинурея-лейцил-гомофенил-виниловый суфолфена фенил (LHVS, цистеин протеазы ориентации соединения) в отношении ингибирования паразита внутриклеточного роста. Также описан протокол удаления генов на основе CRISPR-Cas9 в Токсоплазме с использованием гомологических областей 50 bp для гомологически-зависимой рекомбинации (HDR). Путем количественной оценки эффективности ингибирования LHVS в диком типе и TgCPL (Токсоплазма катепсин L-как протеазы)-дефицитных паразитов, показано, что LHVS ингибирует рост паразитов дикого типа более эффективно, чем рост CPL, предполагая, что TgCPL является целью, что LHVS связывается с в Токсоплазма Высокая чувствительность и легкая работа этого анализа роста на основе люциферазы делают его пригодным для мониторинга пролиферации токсоплазмы и оценки эффективности препарата в высокой пропускной форме.
Introduction
Toxoplasma gondii является весьма успешным обликирующим внутриклеточным паразитом, который поражает примерно треть населения человека. Его высокая скорость передачи в основном объясняется его разнообразными путями передачи, включая потребление недоваренного мяса, воздействие млекопитающих и врожденную передачу во время родов. T. gondii в основном вызывает оппортунистические инфекции, которые могут привести к тяжелой заболеваемости и смертности у лиц с ослабленным иммунитетом1,,2,,3,,4,,5,6. Антибиотики в настоящее время используется для лечения острого токсоплазмоза особенно неэффективны в лечении врожденных и скрытых инфекций и вызвать тяжелые реакции у некоторых людей3,7,8. Таким образом, существует настоятельная необходимость в выявлении новых терапевтических препаратов. Понимание различий в подклеточных процессах в токсоплазме и ее хозяине поможет определить потенциальные цели препарата. Поэтому для изучения роли отдельных генов в токсоплазменеобходимы эффективные и удобные методы манипуляции геномом. Кроме того, Toxoplasma относится к phylum Apicomplexa, которая включает в себя несколько других значительных человеческих патогенов, таких как Plasmodium spp. и Cryptosporidium spp. Таким образом, токсоплазма может быть использована в качестве модели организма, чтобы помочь изучить основные биологии в других паразитов apicomplexan.
Для выявления новых антибиотиков против микробных патогенов, высокая пропускная мощность скрининга библиотеки химических соединений первоначально проводится для определения их эффективности в подавлении роста микробов. До сих пор, несколько микроплит на основе роста анализы были разработаны для измерения внутриклеточного роста Т. gondii (т.е., радиоактивные 3H-uracil инкорпорации на основе количественной количественной ELISA основе обнаружения паразитов с использованием T. gondii-специфическиеантитела10,11, репортер белка на основе измерения с использованием й-galactosidase или YFP-выражения Токсоплазма штаммов12,13, и недавно разработанный высокосодержание изображения анализа14).9
Все эти индивидуальные стратегии имеют уникальные преимущества; однако некоторые ограничения также ограничивают их применение. Например, поскольку токсоплазма может размножаться только в нуклеарных клетках животных, аутофлуоресценция и неспецифические связыванияанти-T. gondii антител к клеткам-хозяинам вызывают вмешательство в измерения на основе флуоресценции. Кроме того, использование радиоактивных изотопов требует особого соблюдения требований безопасности и потенциальных проблем безопасности. Некоторые из этих анализов больше подходят для оценки роста в один момент, а не для непрерывного мониторинга роста.
Здесь представлен люциферазена основе протокола для количественной оценки внутриклеточного роста токсоплазмы. В предыдущем исследовании, NanoLuc luciferase ген был клонирован под toxoplasma тубулина промоутер, и это luciferase экспрессии построить был трансфицирован в дикий тип (RH’ku80ххг штамма) паразитов для создания RHq ku80хххгг::NLuc штамма (именуемый RH’ku80::NLuc далее.15 Этот штамм служил родительским штаммом для внутриклеточного определения роста и удаления генов в этом исследовании. Использование RH qku80::Штамм NLuc, рост паразитов в крайней плоти человека фибробластов (HFFs) был проконтролирован в течение 96 ч период после инфекции для расчета паразита удвоение времени.
Кроме того, эффективность ингибирования LHVS против роста паразитов может быть определена путем построения темпов роста токсоплазмы против последовательных концентраций LHVS для определения значения IC50. Предыдущая литература сообщила, что TgCPL является основной мишенью LHVS у паразитов и что лечение LHVS снижает развитие острых и хронических инфекций токсоплазмы 16,17,18,19. Кроме того, RH’ku80::NLuc был использован в качестве родительского штамма для модификации генома для создания штамма TgCPL-дефицит (RH’ku80qcpl::NLuc), и торможение LHVS был измерен против этого мутанта. Наблюдая upshift ic50 значения для LHVS в TgCPL-дефицитныхпаразитов по сравнению с штаммом WT, было подтверждено, что TgCPL является мишенью LHVS in vivo.
В этом протоколе, RH’ku80::NLuc используется в качестве родительского штамма, который не имеет эффективного негомологического конца присоединения пути (NHEJ), тем самым облегчая двойной кроссовер гомологически химологии-зависимой рекомбинации (HDR)20,21. Кроме того, 50 bp гомологичные области фланговые на обоих концах лекарственной устойчивости кассеты ПЦР. Продукт PCR служит шаблоном ремонта для удаления всего генного локуса через HDR с помощью инструментов редактирования генома на основе CRISPR-Cas9. Такие короткие гомологичные области могут быть легко включены в грунтовки, обеспечивая удобную стратегию для производства шаблона ремонта. Этот протокол может быть изменен для выполнения универсального удаления генов и эндогенных генов пометки.
Например, в нашей последней публикации, три гена протеазы, TgCPL, TgCPB (Токсоплазма катепсин B-как протеазы), и TgSUB1 (Токсоплазма субтилизин-как протеазы 1), были генетически ablated в TgCRT (Токсоплазма хлорокина-резистентность транспортер)15 Кроме того, TgAMN (побудительная аминопептидаза N «TgAMN, TGGT1_221310») был эндогенно помечен15. Лаборатория Лууридо также сообщила об использовании коротких гомологичных областей в диапазоне 40-43 bp для введения направляемой на сайт генной мутации и эндогенного гена, пометки в геноме Токсоплазмы с помощью аналогичного метода22. Эти успешные изменения генома предполагают, что 40-50 bp гомологичная область достаточна для эффективной рекомбинации ДНК в TgKU80-дефицитный штамм, который значительно упрощает манипуляции генома в Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
«Этот протокол описывает протокол на основе люциферазы для оценки роста внутриклеточной токсоплазмы и оценки эффективности ингибирования химических соединений против роста паразитов. По сравнению с существующими стратегиями измерения внутриклеточного роста токсоплазмы, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Сибли и Каррутерс для обмена pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT плазмид и антитела анти-TgCPL и TgActin. Эта работа была поддержана Фондом стартапов Clemson (к З.Д.), Рыцари Тамплиеров Глаз Фонд детской офтальмологии Карьера-Стартер исследований Грант (к З.Д.), пилотный грант NIH COBRE грант P20GM109094 (к З.Д.), и NIH R01AI143707 (к З.Д.). Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
