Bestemmelse av kjemisk inhibitoreffektivitet mot intracellulær toxoplasma Gondii-vekst ved hjelp av en Luciferase-basert vekstanalyse
Summary
Presentert her er en protokoll for å evaluere hemming effekten av kjemiske forbindelser mot in vitro intracellulær vekst av Toxoplasma gondii ved hjelp av en luciferase-basert vekstanalyse. Teknikken brukes til å bekrefte hemmingsspesifisitet ved genetisk sletting av det tilsvarende målgenet. Hemming en LHVS mot TgCPL protease evalueres som et eksempel.
Abstract
Toxoplasma gondii er et protozopatogen som påvirker den menneskelige befolkningen. De nåværende antibiotika som brukes til behandling av klinisk toksoplasmose er begrenset. I tillegg viser de negative bivirkninger i visse grupper av mennesker. Derfor er oppdagelsen av nye terapeutiske midler for klinisk toksoplasmose viktig. Det første trinnet i ny antibiotikautvikling er å identifisere kjemiske forbindelser som viser høy effekt i hemming av parasittvekst ved hjelp av en høy gjennomstrømningsscreeningsstrategi. Som et obligatorisk intracellulært patogen kan Toxoplasma bare replikere i vertsceller, noe som forbyr bruk av optiske absorbansmålinger som en rask indikator på vekst. Presentert her er en detaljert protokoll for en luciferase-basert vekstanalyse. Som et eksempel brukes denne metoden til å beregne doblingstiden til villtype Toxoplasma-parasitter og måle effekten av morfofosin-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone fenyl (LHVS, en cystein protease-målretting sammensatt) om hemming av parasitt intracellulær vekst. Også beskrevet, er en CRISPR-Cas9-basert genslettingsprotokoll i Toxoplasma ved hjelp av 50 bp homologe regioner for homologiavhengig rekombinasjon (HDR). Ved å kvantifisere inhiberingsefficacies av LHVS i villtype og TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-lignende protease)-mangelfulle parasitter, er det vist at LHVS hemmer villtype parasittvekst mer effektivt enn Δcpl vekst, noe som tyder på at TgCPL er et mål som LHVS binder seg til i Toxoplasma. Den høye følsomheten og den enkle driften av denne luciferase-baserte vekstanalysen gjør den egnet for overvåking av Toxoplasma-spredning og evaluering av legemiddeleffekt på en høy gjennomstrømningsmåte.
Introduction
Toxoplasma gondii er en svært vellykket intracellulær parasitt som infiserer omtrent en tredjedel av den menneskelige befolkningen. Den høye overføringshastigheten skyldes hovedsakelig sine ulike overføringsruter, inkludert forbruk av underkokt kjøtt, eksponering for pattedyrreservoarer og medfødt overføring under fødselen. T. gondii forårsaker hovedsakelig opportunistiske infeksjoner som kan føre til alvorlig sykelighet og dødelighet hos immunkompromitterte individer1,2,3,4,5,6. Antibiotika som for tiden brukes til behandling av akutt toksoplasmose er spesielt ineffektive i behandling av medfødte og latente infeksjoner og forårsaker alvorlige reaksjoner hos noen individer3,,7,8. Dermed eksisterer et presserende behov for å identifisere nye terapeutiske midler. Å forstå forskjellene i subcellulære prosesser i Toxoplasma og verten vil bidra til å identifisere potensielle narkotikamål. Derfor er effektive og praktiske genommanipulasjonsteknikker nødvendig for å studere rollene til individuelle gener i Toxoplasma. I tillegg tilhører Toxoplasma phylum Apicomplexa, som inkluderer flere andre signifikante menneskelige patogener, som Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma brukes som modellorganisme for å studere grunnleggende biologi i andre apicomplexan parasitter.
For å identifisere nye antibiotika mot mikrobielle patogener, utføres høy gjennomstrømningsscreening av et bibliotek av kjemiske forbindelser i utgangspunktet for å bestemme deres effekt i undertrykkelsen av mikrobiell vekst. Så langt er det utviklet flere mikroplatebaserte vekstanalyser for måling av intracellulær vekst på T. gondii (dvs. radioaktiv 3H-uracil inkorporeringsbasert kvantifisering9, kvantitativ ELISA-basert parasittdeteksjon ved hjelp av T. gondii-spesifikke antistoffer10,11, reporter proteinbasert måling ved hjelp av β-galaktosidase eller YFP-uttrykkende Toxoplasma stammer12,,13, og en nylig utviklet høyinnholdsbildebehandling analyse14).
Disse individuelle strategiene har alle unike fordeler; Visse begrensninger begrenser imidlertid også søknadene deres. For eksempel, siden Toxoplasma bare kan replikere i kjernerede dyreceller, autofluorescens og ikke-spesifikk binding avanti-T. gondii antistoffer for å være vert for celler forårsake interferens i fluorescensbaserte målinger. Videre krever bruk av radioaktive isotoper spesiell sikkerhetsoverholdelse og potensielle sikkerhetsproblemer. Noen av disse analysene er mer egnet for å vurdere vekst på ett tidspunkt i stedet for kontinuerlig overvåking av vekst.
Presentert her er en luciferase-basert protokoll for kvantifisering av intracellulær Toxoplasma vekst. I en tidligere studie ble NanoLuc luciferase genet klonet under Toxoplasma tubulin promoter, og denne luciferase uttrykkskonstruksjonen ble transfected til villtype (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for å skape en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (referert til som RHΔku80::NLuc heretter)15. Denne belastningen fungerte som foreldrestamme for intracellulær vekstbestemmelse og gensletting i denne studien. Ved hjelp av RHΔku80::NLuc-stamme ble parasittvekst i humane forhudfibroblaster (HFFs) overvåket over en 96 timers periode etter infeksjon for å beregne parasittdoblingstid.
I tillegg kan hemmingseffekten av LHVS mot parasittvekst bestemmes ved å plotte Toxoplasma vekstrater mot seriell LHVS-konsentrasjoner for å identifisere IC50-verdien. Tidligere litteratur har rapportert at TgCPL er et viktig mål for LHVS hos parasitter, og at behandling med LHVS reduserer utviklingen av akutte og kroniske Toxoplasma-infeksjoner 16,17,18,19. I tillegg ble RHΔku80::NLuc brukt som foreldrestamme for genommodifikasjon for å generere en TgCPL-mangelfullstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hemmingen av LHVS ble målt mot denne mutanten. Ved å observere en upshift av IC50 verdier for LHVS i TgCPL-mangelfulleparasitter sammenlignet med WT-stammen, ble det validert at TgCPL er målrettet av LHVS in vivo.
I denne protokollen brukes RHΔku80::NLuc som foreldrestamme, som mangler en effektiv ikke-homolog ende-sammenføyningsvei (NHEJ), og dermed tilrettelegge dobbel crossover homologi-avhengig rekombinasjon (HDR)20,21. I tillegg er 50 bp homologe regioner flankert i begge ender av en legemiddelresistenskassett av PCR. PCR-produktet fungerer som en reparasjonsmal for å fjerne hele genlokusvia HDR ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomredigeringsverktøy. Slike korte homologe regioner kan lett innlemmes i primere, noe som gir en praktisk strategi for produksjon av reparasjonsmalen. Denne protokollen kan endres for å utføre universell gensletting og endogene genmerking.
For eksempel, i vår nyeste publikasjon, ble tre proteasegener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease) og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisinlignende protease 1), genetisk ablated i TgCRT (Toxoplasma klorokin-resistenstransporter)-mangelfulle parasitter ved hjelp av denne metoden15. I tillegg ble TgAMN (en antatt aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogenemerket15. Lourido-laboratoriet rapporterte også at de brukte korte homologe regioner i området 40-43 bp for innføring av stedsstyrt genmutasjon og endogen genmerking i Toxoplasma-genomet ved hjelp av en lignende metode22. Disse vellykkede genommodifikasjonene tyder på at en 40-50 bp homolog region er tilstrekkelig for effektiv DNA-rekombinasjon i TgKU80-mangelfullbelastning, noe som i stor grad forenkler genommanipulasjon i Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Denne protokollen beskriver en luciferase-basert protokoll for å vurdere intracellulær Toxoplasma-vekst og evaluere hemmingseffekten av kjemiske forbindelser mot parasittvekst. Sammenlignet med de eksisterende strategiene som er tilgjengelige for måling av intracellulær Toxoplasma-vekst, viser denne metoden høy følsomhet og spesifisitet. Mens du overvåker parasittvekst, anbefales en mock-analyse i en klar 96 brønnmikroplate for å bekrefte at den testede stammen ikke for tidlig lyse vertscelle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Drs. Sibley og Carruthers for å dele pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid og anti-TgCPL og TgActin antistoffer. Dette arbeidet ble støttet av Clemson Startup fund (til Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (til Z.D.), en pilot bevilgning av en NIH COBRE stipend P20GM109094 (til Z.D.), og NIH R01AI143707 (til Z.D.). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
