Murine Precision-Cut Lever skiver som en Ex Vivo Model af leverbiologi
Summary
Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til produktion af levedygtige præcision-cut leverskiver fra mus. Ex vivo vævsprøver kan opretholdes under laboratorievæv kultur betingelser for flere dage, hvilket giver en fleksibel model til at undersøge leveren patobiologi.
Abstract
Forståelse af mekanismerne i leverskader, leverfibrose, og skrumpelever, der ligger til grund for kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, metabolisk leversygdom, og leverkræft) kræver eksperimentel manipulation af dyremodeller og in vitro-cellekulturer. Begge teknikker har begrænsninger, såsom kravet om et stort antal dyr til in vivo manipulation. In vitro-cellekulturer gengiver dog ikke strukturen og funktionen af det flercellede levermiljø. Brugen af præcision-cut leverskiver er en teknik, hvor ensartede skiver af levedygtige muselever opretholdes i laboratoriet væv kultur for eksperimentel manipulation. Denne teknik indtager en eksperimentel niche, der eksisterer mellem dyreforsøg og in vitro celle kultur metoder. Den præsenterede protokol beskriver en enkel og pålidelig metode til at isolere og kultur præcision-cut leverskiver fra mus. Som en anvendelse af denne teknik, ex vivo leverskiver behandles med galdesyrer til at simulere cholestatisk leverskade og i sidste ende vurdere mekanismerne i hepatisk fibrogenese.
Introduction
Patogenesen af de fleste kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske steatohepatitis, cholestatisk leverskade og leverkræft) indebærer komplekse interaktioner mellem flere forskellige levercelletyper, der driver inflammation, fibrogenesis, og kræft udvikling1,2. For at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse kroniske leverbaserede sygdomme, skal samspillet mellem flere levercelletyper undersøges. Mens flere hepatiske cellelinjer (og for nylig, organoids) kan dyrkes in vitro, disse modeller ikke præcist efterligne den komplekse struktur, funktion, og cellulære mangfoldighed af leveren mikromiljø3. Desuden kan dyrkede leverceller (især transformerede cellelinjer) afvige fra deres oprindelige kildebiologi. Dyremodeller anvendes eksperimentelt til at undersøge samspillet mellem flere levercelletyper. De kan dog blive betydeligt reduceret i mulighederne for eksperimentel manipulation på grund af betydelige off-target-virkninger i ekstrahepatiske organer (f.eks. ved test af potentielle terapeutiske).
Brugen af præcisionsskårne leverskiver (PCLS) i vævskultur er en eksperimentel teknik, der første gang anvendes i lægemiddelmetabolisme- og toksicitetsundersøgelser, og det indebærer skæring af levedygtige, ultratynde (ca. 100−250 μm tykke) leverskiver. Dette muliggør direkte eksperimentel manipulation af levervæv ex vivo4. Teknikken bygger bro mellem in vivo-dyreforsøg og in vitro-cellekulturmetoder og overvinder mange ulemper ved begge metoder (dvs. praktiske grænser for de forskellige forsøgsforsøg, der kan udføres hos hele dyr samt tab af struktur/funktion og cellulær mangfoldighed med in vitro-cellekulturmetoder).
Desuden øger PCLS forsøgskapaciteten betydeligt sammenlignet med hele dyreforsøg. Som en mus kan producere mere end 48 leverskiver, Dette letter også brugen af både kontrol og behandling grupper fra samme lever. Desuden adskiller teknikken fysisk levervævet fra andre organsystemer; Den fjerner derfor potentielle off-target-effekter, der kan opstå hos hele dyr, når virkningerne af udefrakommende stimuli testes.
I denne protokol genereres PCLS ved hjælp af en vibratome med en sideværts vibrerende klinge. Andre undersøgelser har med succes brugt en Krumdieck væv pålægsmaskine, som beskrevet i Olinga og Schuppan5. I vibratomen forhindrer lateral vibration af klingen at rive det ultratynde væv på grund af forskydningsstress, da klingen skubbes ind i vævet. Både vibratome og Krumdieck væv pålægsmaskine arbejde effektivt uden strukturel indlejring af levervæv, som strømliner udskæring procedure. Denne teknik kan også bruges til at skabe PCLS fra syge lever, herunder dem fra musemodeller af fibrose/ skrumpelever6 og leversteatose7.
Ud over at demonstrere de teknikker, der er nødvendige for fremstilling og vævskultur af PCLS, undersøger denne rapport også levedygtigheden af disse ex vivo-væv ved at måle adenosintrifosfat (ATP) niveauer og undersøge vævhistologi til vurdering af nekrose og fibrose. Som en repræsentativ eksperimentel procedure behandles PCLS med patofysiologiske koncentrationer af tre forskellige galdesyrer (glykocholic, taurocholic og cholic syrer) for at simulere cholestatisk leverskade. I forbindelse med kolestatisk leverskade har især taurocholic syre vist sig at være signifikant forøget i både serum og galde hos børn med cystisk fibroserelateret leversygdom8.
Leverstamceller er også blevet behandlet in vitro med taurocholic syre for at simulere de forhøjede taurocholic syreniveauer observeret hos patienter, og denne behandling forårsagede øget spredning og differentiering af leverstamceller mod en galde (cholangiocyt) fænotype9. Efterfølgende blev PCLS behandlet ex vivo med forhøjede niveauer af taurocholic syre, og øget cholangiocyt markører blev observeret. Dette understøtter in vitro observation, at taurocholic syre drev galdespredning og / eller differentiering i forbindelse med pædiatriske cystisk fibrose-associeret leversygdom9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen viser anvendelsen af murine PCLS isolation og væv kultur, og procedurerne er designet til at vurdere både levedygtighed og nytte samt undersøge virkningerne af udefrakommende mediatorer af leverenpatobiologi ved hjælp af biokemiske assays, histologi, og qPCR. Den eksperimentelle nytte af PCLS vævkultur hos gnavere og mennesker er blevet påvist i en bred vifte af applikationer, herunder eksperimentelle undersøgelser i microRNA15/RNA9/ protein udtryk<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Grant No. APP1048740 og APP1142394 til G.A.R.; APP1160323 til J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm støttes af et Senior Research Fellowship fra NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo blev støttet af TALENTO-programmet i Madrid, Spanien (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta – Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
