Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática
Summary
Este protocolo proporciona un método simple y confiable para la producción de rodajas de hígado de piedra de precisión viables de ratones. Las muestras de tejido ex vivo se pueden mantener bajo condiciones de cultivo de tejido de laboratorio durante varios días, proporcionando un modelo flexible para examinar la patobiología hepática.
Abstract
Comprender los mecanismos de lesión hepática, fibrosis hepática y cirrosis que subyacen a las enfermedades hepáticas crónicas (es decir, hepatitis viral, enfermedad hepática grasa no alcohólica, enfermedad hepática metabólica y cáncer de hígado) requiere la manipulación experimental de modelos animales y cultivos celulares in vitro. Ambas técnicas tienen limitaciones, como el requisito de un gran número de animales para la manipulación in vivo. Sin embargo, los cultivos celulares in vitro no reproducen la estructura y la función del entorno hepático multicelular. El uso de rodajas de hígado cortadas con precisión es una técnica en la que las rebanadas uniformes de hígado de ratón viable se mantienen en el cultivo de tejido de laboratorio para la manipulación experimental. Esta técnica ocupa un nicho experimental que existe entre los estudios en animales y los métodos de cultivo celular in vitro. El protocolo presentado describe un método sencillo y confiable para aislar y cultivar rebanadas de hígado cortadas con precisión de ratones. Como aplicación de esta técnica, las rodajas de hígado ex vivo se tratan con ácidos biliares para simular una lesión hepática colestásica y, en última instancia, evaluar los mecanismos de la fibrogénesis hepática.
Introduction
La patogénesis de la mayoría de las enfermedades hepáticas crónicas (es decir, hepatitis viral, esteatohepatitis no alcohólica, lesión hepática colestásica y cáncer de hígado) implica interacciones complejas entre múltiples tipos diferentes de células hepáticas que impulsan la inflamación, la fibrogénesis y el desarrollo del cáncer1,2. Para entender los mecanismos moleculares subyacentes a estas enfermedades crónicas basadas en el hígado, se deben investigar las interacciones entre múltiples tipos de células hepáticas. Mientras que múltiples líneas celulares hepáticas (y más recientemente, organoides) se pueden cultivar in vitro, estos modelos no emulan con precisión la compleja estructura, función y diversidad celular del microambiente hepático3. Además, las células hepáticas cultivadas (en particular, líneas celulares transformadas) pueden desviarse de su biología original de origen. Los modelos animales se utilizan experimentalmente para investigar las interacciones entre múltiples tipos de células hepáticas. Sin embargo, pueden reducirse significativamente en el alcance de la manipulación experimental, debido a efectos significativos fuera del objetivo en órganos extrahepáticos (por ejemplo, al probar posibles terapias).
El uso de rodajas de hígado cortadas con precisión (PCLS) en el cultivo de tejidos es una técnica experimental utilizada por primera vez en estudios de metabolismo y toxicidad de fármacos, e implica el corte de rodajas de hígado viables, ultradelgadas (alrededor de 100 a 250 m de espesor). Esto permite la manipulación experimental directa del tejido hepático ex vivo4. La técnica cierra una brecha experimental entre los estudios en animales in vivo y los métodos de cultivo celular in vitro, superando muchos inconvenientes de ambos métodos (es decir, límites prácticos en la gama de experimentos que se pueden realizar en animales enteros, así como la pérdida de estructura/función y diversidad celular con métodos de cultivo celular in vitro).
Además, PCLS aumenta enormemente la capacidad experimental en comparación con estudios en animales enteros. Como un ratón puede producir más de 48 rodajas de hígado, esto también facilita el uso de grupos de control y tratamiento desde el mismo hígado. Además, la técnica separa físicamente el tejido hepático de otros sistemas de órganos; por lo tanto, elimina los posibles efectos fuera del objetivo que pueden ocurrir en animales enteros al probar los efectos de los estímulos exógenos.
En este protocolo, pclS se generan utilizando un vibratome con una hoja vibratoria lateral. Otros estudios han utilizado con éxito una cortadora de tejido Krumdieck, como se describe en Olinga y Schuppan5. En el vibratome, la vibración lateral de la hoja evita el desgarro del tejido ultrafino causado por la tensión de cizallamiento, ya que la hoja se empuja hacia el tejido. Tanto el vibratomo como la cortadora de tejido Krumdieck funcionan eficazmente sin incrustación estructural de tejido hepático, lo que agiliza el procedimiento de corte. Esta técnica también se puede utilizar para crear PCLS a partir de hígados enfermos, incluidos los de modelos de ratón de fibrosis/cirrosis6 y esteatosis hepática7.
Además de demostrar las técnicas necesarias para la preparación y el cultivo de tejidos de PCLS, este informe también examina la viabilidad de estos tejidos ex vivo midiendo los niveles de trifosfato de adenosina (ATP) y examinando la histología de tejidos para evaluar la necrosis y la fibrosis. Como procedimiento experimental representativo, el PCLS se trata con concentraciones fisiopatológicas de tres ácidos biliares diferentes (ácidos glucódicos, taurocólicos y cólicos) para simular lesiones hepáticas colestásicas. En el contexto de una lesión hepática colestásica, el ácido taurocólico en particular ha demostrado aumentar significativamente tanto en el suero como en la bilis de los niños con enfermedad hepática asociada a la fibrosis quística8.
Las células progenitoras hepáticas también se han tratado in vitro con ácido taurocólico para simular los niveles elevados de ácido taurocólico observados en los pacientes, y este tratamiento causó una mayor proliferación y diferenciación de las células progenitoras hepáticas hacia un fenotipo biliar (cholangiocitos)9. Posteriormente, el PCLS se trató ex vivo con niveles elevados de ácido taurocólico, y se observaron un aumento de los marcadores de colangiocitos. Esto apoya la observación in vitro de que el ácido taurocólico impulsa la proliferación biliar y / o diferenciación en el contexto de la enfermedad hepática asociada a la fibrosis quística pediátrica9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo demuestra la aplicación del aislamiento de PCLS murino y el cultivo de tejidos, y los procedimientos están diseñados para evaluar tanto la viabilidad como la utilidad, así como examinar los impactos de los mediadores exógenos de la patología hepática utilizando ensayos bioquímicos, histología y qPCR. La utilidad experimental del cultivo de tejido PCLS en roedores y humanos se ha demostrado en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo investigaciones experimentales en microARN15</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) de Australia (Grant No. APP1048740 y APP1142394 a G.A.R.; APP1160323 a J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm cuenta con el apoyo de una Beca Senior de Investigación de la NHMRC de Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernández-Rojo contó con el apoyo del programa TALENTO de Madrid, España (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
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