Her beskriver vi en detaljert og reproduserbar strømningscytometriprotokoll for å identifisere monocytt/makrofag og T-celleundergrupper ved hjelp av både ekstra- og intracellulære fargingsanalyser innenfor murinsplitten, benmargen, lymfeknuter og synovialvev, ved hjelp av en etablert kirurgisk modell av murinslitasjegikt.
Artrose (OA) er en av de mest utbredte muskel- og skjelettsykdommene, som påvirker pasienter som lider av smerte og fysiske begrensninger. Nyere bevis indikerer en potensiell inflammatorisk komponent av sykdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potensielt forbundet med patogenesen av OA. Videre studier postulerte en viktig rolle for undergrupper av begge inflammatoriske celleavsnæringer, som Th1, Th2, Th17 og T-regulatoriske lymfocytter, og M1, M2, og synovium-vev-bosatt makrofager. Interaksjonen mellom den lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulær respons og de strukturelle endringene i leddet er imidlertid ukjent. For å fullt ut forstå hvordan T-celler og monocytter / makrofager bidrar mot OA, er det viktig å kunne kvantifisere disse cellene og deres undergrupper samtidig i synovialvev, sekundære lymfatiske organer og systemisk (milten og benmargen). I dag kan de forskjellige inflammatoriske celleundersettene identifiseres ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører som gjør multi-fargeflytcytometri til en kraftig teknikk for å undersøke disse cellulære prosessene. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn om høsting av synovialt vev og sekundære lymfatiske organer, samt generering av enkeltcellesuspensjoner. Videre presenterer vi både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra- og intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innenfor murinspleten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller.
Artrose (OA) er en ødeleggende og smertefull sykdom som involverer ulike patologier i alle vev forbundet med ledd1. Påvirker ca 3,8% av den globalebefolkningen 2, OA er en av de mest utbredte muskel-skjelettsykdommer, og det er å bli den fjerde ledende årsaken tilfunksjonshemming over hele verden innen 20203. Posttraumatisk OA oppstår etter en leddskade og står for minst 12% av alle OA og opptil 25% av OA i mottakelige ledd som kneet4,5. Videre øker leddskaden livstidsrisikoen for OA med mer enn fem ganger6. Ikke alle skader med tilsynelatende lignende ustabilitet vil fortsette å utvikle OA, og derfor er det fortsatt utfordrende å definere faktorer som driver den langsiktige OA-risikoen. Det er avgjørende for å utvikle effektive behandlinger for å forebygge og/ eller behandle posttraumatisk OA, for å undersøke og bedre definere den skadespesifikke patologien, årsakene og mekanismene som predisponerer for OA1.
OA og dens definerende bruskødeleggelse ble tidligere tilskrevet helt og holdent til mekanisk stress, og dermed ble OA ansett som en ikke-inflammatorisk sykdom2. Nyere studier har imidlertid vist en inflammatorisk infiltrasjon av synovialmer og en økning av inflammatoriske celler i synovialvevet hos pasienter med OA sammenlignet med friske kontroller2, kaster lys over en inflammatorisk komponent som en potensiell drivkraft i OA. Videre studier indikerte at abnormiteter i både CD4 + og CD8 + T-celleprofil samt monocytter / makrofager i det medfødte immunsystemet kan bidra til patogenesen av OA2,7. Detaljerte undersøkelser av disse abnormitetene viste relevante roller for ulike T-celleundergrupper2, for eksempel Th18, Th29, Th178 og T regulatoriske (Treg)populasjoner 10,11. Til tross for dette overbevisende beviset er årsakssammenhenget mellom endringen av T-celleresponser og utviklingen og utviklingen av OA fortsatt ukjent2.
I tillegg til at spesifikke T-celler har en rolle i OA, tyder nyere studier på at differensialt polariserte /aktiverte makrofager kan være forbundet med patogenese av OA12. Spesielt akkumuleres makrofager som stammer fra blodmonocytter i synoviumet og polariserer til enten klassisk aktiverte makrofager (M1) eller alternativt aktiverte makrofager (M2) under OA-utvikling, noe som innebærer en sammenheng mellom monocyttavledede makrofager og OA13. I motsetning, visse undergrupper av makrofager fylle organer tidlig under utvikling og selvoppholde sine tall i en monocytt uavhengig sak14. Nylig ble en felles beskyttende funksjon mediert av en tett veikryssbarriere vist for disse synovial-vev-resident makrofager (STRMs)14. Disse funnene tyder på at abnormiteter spesielt makrofagsundersett kan spille en avgjørende rolle under utviklingen av OA. Interaksjonene mellom denne inflammatoriske cellulære responsen og de strukturelle endringene i leddet etter traumer er imidlertid ukjent.
Historisk sett var analyse av immunceller i synovialvevet begrenset til immunohistokjemi (IHC) eller mRNA-uttrykk ved omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) nærmerseg 15,,16. Imidlertid mangler både IHC og RT-PCR muligheten til å identifisere flere forskjellige celletyper og deres undergrupper samtidig, og dermed begrense anvendeligheten til disse metodene. Videre er IHC begrenset til analyse av små prøver av vev og kan gå glipp av fokale inflammatoriske celleakkumuleringer. I løpet av de siste årene har en myriade av overflatemarkører for ulike celletyper blitt utviklet, og undergrupper av immunceller kan nå identifiseres pålitelig ved forskjellige kombinasjoner av disse markørene. På grunn av jevn teknisk fremgang er strømningssytometre nå i stand til å identifisere en rekke forskjellige fluorokromer samtidig som det muliggjør analyse av store flerfargede antistoffpaneler.
Flow cytometri gir etterforskerne en kraftig teknikk som tillater samtidig identifisering og kvantifisering av en rekke immunceller og deres undergrupper på enkeltcellenivå. Vi har utviklet og optimalisert både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra / intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innen murin milt, benmarg, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller17.
Metodene som er beskrevet i denne protokollen er utformet og testet for å pålitelig identifisere ulike undergrupper fra både monocytter / makrofager og T-celler i murin milten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev i en murinmodell av slitasjegikt (OA). Den nåværende protokollen kan enkelt endres for å undersøke ulike vevstyper, eller andre celletyper ved å utveksle antistoffer, og kan brukes til alternative murine modeller av OA. Når du tester andre vevstyper, er det viktig å teste spesifisiteten til hvert a…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Andrew Lim, Ph.D. og Giles Best, Ph.D. for deres hjelp til å sette opp flytcytometeret. Dette prosjektet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) tildelt PH.
APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |