Flow Cytometry Analyse av immuncelle undergrupper innenfor Murine Milten, Benmarg, Lymfeknuter og synovialvev i en slitasjegikt modell

Summary

Her beskriver vi en detaljert og reproduserbar strømningscytometriprotokoll for å identifisere monocytt/makrofag og T-celleundergrupper ved hjelp av både ekstra- og intracellulære fargingsanalyser innenfor murinsplitten, benmargen, lymfeknuter og synovialvev, ved hjelp av en etablert kirurgisk modell av murinslitasjegikt.

Abstract

Artrose (OA) er en av de mest utbredte muskel- og skjelettsykdommene, som påvirker pasienter som lider av smerte og fysiske begrensninger. Nyere bevis indikerer en potensiell inflammatorisk komponent av sykdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potensielt forbundet med patogenesen av OA. Videre studier postulerte en viktig rolle for undergrupper av begge inflammatoriske celleavsnæringer, som Th1, Th2, Th17 og T-regulatoriske lymfocytter, og M1, M2, og synovium-vev-bosatt makrofager. Interaksjonen mellom den lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulær respons og de strukturelle endringene i leddet er imidlertid ukjent. For å fullt ut forstå hvordan T-celler og monocytter / makrofager bidrar mot OA, er det viktig å kunne kvantifisere disse cellene og deres undergrupper samtidig i synovialvev, sekundære lymfatiske organer og systemisk (milten og benmargen). I dag kan de forskjellige inflammatoriske celleundersettene identifiseres ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører som gjør multi-fargeflytcytometri til en kraftig teknikk for å undersøke disse cellulære prosessene. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn om høsting av synovialt vev og sekundære lymfatiske organer, samt generering av enkeltcellesuspensjoner. Videre presenterer vi både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra- og intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innenfor murinspleten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller.

Introduction

Artrose (OA) er en ødeleggende og smertefull sykdom som involverer ulike patologier i alle vev forbundet med ledd¹. Påvirker ca 3,8% av den globale^{befolkningen 2}, OA er en av de mest utbredte muskel-skjelettsykdommer, og det er å bli den fjerde ledende årsaken til^{funksjonshemming} over hele verden innen 2020³. Posttraumatisk OA oppstår etter en leddskade og står for minst 12% av alle OA og opptil 25% av OA i mottakelige ledd som kneet^4,5. Videre øker leddskaden livstidsrisikoen for OA med mer enn fem ganger⁶. Ikke alle skader med tilsynelatende lignende ustabilitet vil fortsette å utvikle OA, og derfor er det fortsatt utfordrende å definere faktorer som driver den langsiktige OA-risikoen. Det er avgjørende for å utvikle effektive behandlinger for å forebygge og/ eller behandle posttraumatisk OA, for å undersøke og bedre definere den skadespesifikke patologien, årsakene og mekanismene som predisponerer for OA¹.

OA og dens definerende bruskødeleggelse ble tidligere tilskrevet helt og holdent til mekanisk stress, og dermed ble OA ansett som en ikke-inflammatorisk sykdom². Nyere studier har imidlertid vist en inflammatorisk infiltrasjon av synovialmer og en økning av inflammatoriske celler i synovialvevet hos pasienter med OA sammenlignet med friske kontroller², kaster lys over en inflammatorisk komponent som en potensiell drivkraft i OA. Videre studier indikerte at abnormiteter i både CD4 + og CD8 + T-celleprofil samt monocytter / makrofager i det medfødte immunsystemet kan bidra til patogenesen av OA^2,7. Detaljerte undersøkelser av disse abnormitetene viste relevante roller for ulike T-celleundergrupper², for eksempel Th1⁸, Th2⁹, Th17⁸ og T regulatoriske (Treg)^{populasjoner 10,11}. Til tross for dette overbevisende beviset er årsakssammenhenget mellom endringen av T-celleresponser og utviklingen og utviklingen av OA fortsatt ukjent².

I tillegg til at spesifikke T-celler har en rolle i OA, tyder nyere studier på at differensialt polariserte /aktiverte makrofager kan være forbundet med patogenese av OA¹². Spesielt akkumuleres makrofager som stammer fra blodmonocytter i synoviumet og polariserer til enten klassisk aktiverte makrofager (M1) eller alternativt aktiverte makrofager (M2) under OA-utvikling, noe som innebærer en sammenheng mellom monocyttavledede makrofager og OA¹³. I motsetning, visse undergrupper av makrofager fylle organer tidlig under utvikling og selvoppholde sine tall i en monocytt uavhengig sak¹⁴. Nylig ble en felles beskyttende funksjon mediert av en tett veikryssbarriere vist for disse synovial-vev-resident makrofager (STRMs)¹⁴. Disse funnene tyder på at abnormiteter spesielt makrofagsundersett kan spille en avgjørende rolle under utviklingen av OA. Interaksjonene mellom denne inflammatoriske cellulære responsen og de strukturelle endringene i leddet etter traumer er imidlertid ukjent.

Historisk sett var analyse av immunceller i synovialvevet begrenset til immunohistokjemi (IHC) eller mRNA-uttrykk ved omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) nærmer^{seg 15,,16}. Imidlertid mangler både IHC og RT-PCR muligheten til å identifisere flere forskjellige celletyper og deres undergrupper samtidig, og dermed begrense anvendeligheten til disse metodene. Videre er IHC begrenset til analyse av små prøver av vev og kan gå glipp av fokale inflammatoriske celleakkumuleringer. I løpet av de siste årene har en myriade av overflatemarkører for ulike celletyper blitt utviklet, og undergrupper av immunceller kan nå identifiseres pålitelig ved forskjellige kombinasjoner av disse markørene. På grunn av jevn teknisk fremgang er strømningssytometre nå i stand til å identifisere en rekke forskjellige fluorokromer samtidig som det muliggjør analyse av store flerfargede antistoffpaneler.

Flow cytometri gir etterforskerne en kraftig teknikk som tillater samtidig identifisering og kvantifisering av en rekke immunceller og deres undergrupper på enkeltcellenivå. Vi har utviklet og optimalisert både en ekstracellulær fargingsanalyse for å identifisere monocytter / makrofager og deres undergrupper, samt en ekstra / intracellulær fargingsanalyse for å identifisere T-celler og deres undergrupper innen murin milt, benmarg, lymfeknuter og synovialt vev. Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert og testet, noe som resulterte i en svært reproduserbar analyse som kan brukes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-musemodeller¹⁷.

Protocol

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkjent alle prosedyrer nevnt i denne protokollen. Mus er plassert og tatt vare på i samsvar med Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr (National Health and Medical Research Council of Australia Revidert 2010). For alle eksperimenter 10-12 uker gamle, mannlige C57BL/6 mus ble brukt. MERK: For å indusere posttraumatisk OA ble kirurgisk destabilisering av den mediale menisken (DMM) i høyre kvelende ledd ut…

Representative Results

Representative resultater fra både monocyttdelpanel og T-celledelsettpanel er beskrevet nedenfor. Figur 1 illustrerer den hierarkiske gating strategien for monocytt undergruppe panel på immunceller samlet fra benmarg av DMM behandlet dyr. Den samme strategien ble brukt og verifisert i alle andre vevstyper. Når du konfigurerer eksperimentet, ble spenningen Forward Scatter Area (FSC-A) og Side Scatter Area (SSC-A) bestemt for hver vevstype for å identifisere mon…

Discussion

Metodene som er beskrevet i denne protokollen er utformet og testet for å pålitelig identifisere ulike undergrupper fra både monocytter / makrofager og T-celler i murin milten, benmargen, lymfeknuter og synovialt vev i en murinmodell av slitasjegikt (OA). Den nåværende protokollen kan enkelt endres for å undersøke ulike vevstyper, eller andre celletyper ved å utveksle antistoffer, og kan brukes til alternative murine modeller av OA. Når du tester andre vevstyper, er det viktig å teste spesifisiteten til hvert a…

Materials

APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers