Vi beskriver en intracisternal injeksjon som bruker en nål bøyd på spissen som kan stabiliseres til skallen, og dermed eliminere risikoen for skade på den underliggende parenchyma. Tilnærmingen kan brukes til genetisk skjebnekartlegging og manipulasjoner av leptomeningeale celler og for sporing av cerebrospinalvæskebevegelse.
Protokollen som er skissert her beskriver hvordan man trygt og manuelt injiserer løsninger gjennom cisternamagnamens eliminere risikoen for skade på den underliggende parenchyma. Tidligere publiserte protokoller anbefaler å bruke rette nåler som bør senkes til maksimalt 1-2 mm fra duraloverflaten. Det plutselige fallet i motstand når duralmembranen er punktert gjør det vanskelig å opprettholde nålen i en jevn posisjon. Vår metode bruker i stedet en nål bøyd på spissen som kan stabiliseres mot halebenets oksipitalbe, og dermed hindrer sprøyten i å trenge inn i vevet etter perforering av duralmembranen. Prosedyren er enkel, reproduserbar, og forårsaker ikke langvarig ubehag hos de opererte dyrene. Vi beskriver den intracisternal injeksjon strategi i sammenheng med genetisk skjebne kartlegging av vaskulære leptomeningeal celler. Den samme teknikken kan videre brukes til å ta opp et bredt spekter av forskningsspørsmål, for eksempel å undersøke leptomeningenes rolle i nevroutvikling og spredning av bakteriell meningitt, gjennom genetisk ablasjon av gener som er putativt innblandet i disse fenomenene. I tillegg kan prosedyren kombineres med et automatisert infusjonssystem for en konstant levering og brukes til å spore cerebrospinalvæskebevegelse via injeksjon av fluorescerende merkede molekyler.
Leptomeningeal celler er en fibroblast-lignende populasjon av celler organisert i et tynt lag overliggende hjernen og uttrykker gener innblandet i kollagen crosslinking (f.eks Dcn og Lum),og i etableringen av en hjerne-meningeal barriere (f.eks Cldn11)1,2. Leptomeningeal celler er innblandet i et bredt spekter av fysiologiske funksjoner, fra streng kontroll over cerebrospinalvæskedrenering3 til veiledning av nevrale stamfarer i den utviklende hjernen4,5. En fersk studie har også foreslått at leptomeninger hos nyfødte kan havne radiale glia-lignende celler som migrerer inn i hjernen parenchyma og utvikle seg til funksjonelle kortikale nevroner6.
Leptomeningeal celler ligger i nærheten av overflate astrocytter og dele med dem, samt andre parenchymal astroglia, uttrykk for connexin-30 (Cx30)7. Den kirurgiske prosedyren som er skissert nedenfor, tillater utbredt og spesifikk merking av disse meningealcellene via en engangslevering av endoksifen i cisternamagnat av transgene mus som betinget uttrykker tdTomato i Cx30+ celler (dvs. ved hjelp av et CreER-loxP-system for fate mapping). Endoxifen er en aktiv metabolitt av Tamoxifen og induserer rekombinasjon av CreER-uttrykkende celler på samme måte som Tamoxifen gjør. Det er imidlertid den anbefalte løsningen for aktuell applikasjon fordi den oppløses i 5-10% DMSO, i stedet for høye konsentrasjoner av etanol. I tillegg krysser endoksifen ikke hjerne-meningeal barrieren, og muliggjør dermed spesifikk rekombinasjon av leptomeningeal celler, uten merking av den underliggende Cx30+ astroglial populasjonen (se Representative Resultater).
Teknikken som presenteres her tar sikte på manuelt og trygt injisere forbindelsen i cerebrospinalvæsken, via direkte tilgang til cisterna magna. I motsetning til andre, mer invasive prosedyrer som krever kraniotomi, gjør denne tilnærmingen det mulig å infuse forbindelser uten å forårsake skade på skallen eller hjerneparenchyma. Dermed er det ikke forbundet med induksjon av inflammatoriske reaksjoner utløst av aktivering av parenchymal gliaceller. I likhet med andre injeksjonsstrategier beskrevet før8,9,10, er den nåværende tilnærmingen avhengig av kirurgisk eksponering av atlanto-occipital dural membran som dekker cisterna magna, etter sløv disseksjon av overliggende nakkemuskler. Men i motsetning til andre prosedyrer anbefaler vi bruk av en nål bøyd på spissen, som kan stabiliseres mot occipital bein under administrasjon. Dette vil forhindre risikoen for at nålen trenger for dypt og skader den underliggende lillehjernen og medulla.
Denne kirurgiske prosedyren er kompatibel med avstamning sporing undersøkelser som tar sikte på å kartlegge endringer i celle identiteter og migrasjon ruter gjennom parenchymal lag. Det kan også tilpasses genetiske ablasjonsstudier som har til hensikt å undersøke rollen som leptomeningeal celler i helse og sykdom, for eksempel deres bidrag til kortikal utvikling5 eller spredning av bakteriell meningitt3,11. Til slutt kan det brukes til å spore cerebrospinalvæskebevegelse når det kombineres med levering av fluorescerende tracers i villtypedyr.
Protokollen skissert her presenterer en enkel og reproduserbar prosedyre for å merke leptomeningeal celler for skjebnekartlegging. Vi bruker intracisternal injeksjon av endoksifen, en aktiv metabolitt av Tamoxifen, for å indusere uttrykk for tdTomato fluorescerende reporter i Cx30-CreER; R26R-tdTomatmus12,13.
Sammenlignet med andre protokoller som brukes for å få tilgang til cerebrospinalvæsken gjennom cisterna magna<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Det svenske forskningsrådet, Det svenske kreftforbundet, Den svenske stiftelsen for strategisk forskning, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse og Det strategiske forskningsprogrammet i stamceller og regenerativ medisin ved Karolinska Institutet (StratRegen).
Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
Shaver | Aesculap | GT420 | |
Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |