Hücresel Kuruluş ve Daha Sonra Kimyasal Synthetized Demir Oksit Nanopartiküllerinin Biyobozunurluğunu İzlemek için ManyetometriNin Kullanılması
Summary
Demir oksit nanopartiküller, zararsız bir sol jel prosedürü ile sentezlenir ve anionik kısa moleküller veya polimer ile kaplanır. İnsan kök hücrelerinin içindeki manyetik nanopartiküllerin birleştirilmesi ve biyotransformasyonlarını izlemek için manyetometri kullanımı titreşimli bir örnek manyetometre (VSM) kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Demir oksittan yapılmış manyetik nanopartiküller, genellikle hücrelerde içselleştirildikleri ve daha sonra içinde bırakıldıkları çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için tuhaf bir ilgi sunar. Bir zorluk, hücre içi ortamdaki kaderlerini güvenilir ve kesin metodolojilerle değerlendirmektir. Burada, manyetik momentlerini ölçerek hücreler içindeki manyetik nanopartiküllerin bütünlüğünü hassas bir şekilde ölçmek için titreşimli numune manyetometresinin (VSM) kullanımını tanıtıyoruz. Kök hücreler ilk olarak iki tür manyetik nanopartikül ile etiketlenir; nanopartiküller hızlı ve verimli bir mikrodalga bazlı nonaqueous sol jel sentezi ile üretilen aynı çekirdeğe sahiptir ve kaplamalarında farklılık gösterir: yaygın olarak kullanılan sitrik asit molekülü poliakrilik asit ile karşılaştırılır. Daha sonra santrifüjleme ile 3D hücre-sferoidlerin oluşumu sağlanır ve bu sferoidlerin manyetik momenti VSM ile farklı zamanlarda ölçülür. Elde edilen an, nanopartiküllerin bütünlüğünün doğrudan bir parmak izidir ve azalan değerler nanopartikül bozulmasının göstergesidir. Her iki nanopartikül için de manyetik moment kültür zamanla azalır ve biyobozunurluklarını ortaya çıkarır. Sitrik aside kıyasla poliakrilik asit kaplamasının koruyucu bir etkisi de gösterilmiştir.
Introduction
Çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için demir oksit nanopartiküllerin manyetik özelliklerine ilgi artmaktadır. Manyetik rezonansa verdikleri yanıt, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenilir kontrast ajanları yapar, manyetik nanopartiküllerle etiketlenmiş hücrelerin implantasyondan sonra in vivo olarak izlenebildiği rejeneratif tıpta biravantajdır 1. Manyetik alanlar kullanılarak, hücreler uzaktan da yönlendirilebilir; bu şekilde, hücresel sferoidler2,3, halkalar4veyalevhalar 5 manyetik olarak mühendislik yapılabilir ve ayrıca uzaktan uyarılabilir6, iskelesiz dokuların geliştirilmesinde bir varlık. Bu nanopartiküller için olasılıklar yelpazesi ayrıca ilaç dağıtım sistemleri7,8 ve kanserli hücreleri öldürmek için manyetik ve fotoindüklenmiş hipertermal tedaviyi içerir9,10,11. Tüm bu uygulamalar için nanopartiküller ya intravenöz enjeksiyonla ya da hücrelerde doğrudan içselleştirme yoluyla biyolojik ortama entegre edilir ve daha sonra hücre içi kaderlerini sorgulayan içinde bırakılır.
In vivo analizler nanopartiküllerin organizmadaki kaderi hakkında genel bir anlayış aktardı: kan akışına enjekte edildikten sonra, ilk olarak karaciğerin makrofajları (Kupffer hücreleri), dalak ve kemik iliği tarafından yakalanır, giderek bozulur ve organizmanın demir havuzuna katılır12,13,14,15,16,17,18,19. Nitel gözlemler sadece nanopartiküllerin organizma boyunca dolaşımı nedeniyle mümkündür. Tipik olarak, iletim elektronik mikroskopisi (TEM) nanopartikülleri doğrudan gözlemlemek için kullanılabilir ve organlardaki demir varlığı dozaj yoluyla belirlenebilir. Daha yakın zamanlarda, kaderleri doğrudan bir hücre havuzu üzerinde değerlendirildi, yani demir kaçışı olmayan yakın devrede, hücre düzeyinde biyotransformasyonlarının nicel bir ölçümüne izin verdi20,21,22. Bu tür ölçümler, nanopartiküllerin yapısal bütünlüklerine sıkıca bağlı manyetik özelliklerinin analizi ile mümkündür. Titreşimli numune manyetometrisi (VSM), numunenin periyodik olarak titreştirildiği bir tekniktir, böylece akı indüklenen bobin ölçümü, numunenin uygulanan manyetik alandaki manyetik momentini sağlar. Bu tür senkron algılama, çok sayıda numunenin manyetik anlarını belirlemek için bir varlık olan hızlı bir ölçüme izin verir20,21,22,23. VSM tarafından alınan makroskopik manyetik imza daha sonra nanopartiküllerin boyutu ve yapısıyla doğrudan ilişkili tüm biyolojik numuneye nicel bir genel bakış sağlar. Özellikle, numunelerin doygunluğundaki manyetik anı (DAÜ’de ifade edilir) sağlar, bu da numunede bulunan manyetik nanopartikül sayısının doğrudan bir nicelemesidir, sırasıyla spesifik manyetik özelliklerine.
Manyetik nanopartiküllerin hücre içi işlenmesinin yapısal özelliklerine sıkıca bağlı olduğu gösterilmiştir20. Bu özellikler optimum sentez protokolleri ile kontrol edilebilir. Her protokol avantajlar ve sınırlamalar sunar. Demir oksit nanopartikülleri genellikle demir iyonlarının koprecipitasyonu yoluyla sulu çözeltilerde sentezlenir24. Nanopartikül boyutu polidisperitesinin sınırlamalarını aşmak için poliol aracılı sol jel yöntemleri gibi diğer sentez yöntemleri geliştirilmiştir25. Termal ayrışma ile gereksiz yaklaşımlar çok iyi kalibre edilmiş demir oksit nanopartiküllerinin üretimine yol açar26. Bununla birlikte, oleylamin veya oleik asit gibi büyük miktarlarda yüzey aktif madde kullanımı, biyomedikal uygulamalar için işlevselleşmelerini ve su transferlerini zorlaştırmaz. Bu nedenle, bu tür manyetik nanopartikülleri yüksek kristalite, saflık ve tekrarlanabilirliğe yol açan zararsız bir sol jel rotası ile sentezleriz27. Bu protokol, sıcaklık değişimi28ile ayarlanabilen iyi kontrol edilen boyut nanopartikülleri üretir. Bununla birlikte, mikrodalga destekli sulu olmayan sol-jel rotası, elde edilen nanopartiküllerin yaklaşık 12 nm’lik bir üst boyut sınırına sahiptir. Bu prosedür oda sıcaklığında ferromanyetik parçacıklar kullanan uygulamalar için uyarlanmaz. Çekirdek sentezine ek olarak, dikkat edilmesi gereken bir diğer ana özellik kaplamadır. Nanopartikül yüzeyinde yatan kaplama, nanopartiküllerin hedeflenen içselleştirilmesine yardımcı olan bir ankraj molekülü görevi görür veya nanopartikülleri bozulmaya karşı koruyabilir. Benzil alkol aynı zamanda bir oksijen kaynağı ve bir ligand görevi gördüğünden, ek yüzey aktif madde veya ligandlara ihtiyaç duymadan çıplak nanopartiküller üretilir. Nanopartiküller daha sonra bir yüzey aktif madde değişim işlemi olmadan sentezden sonra kolayca yüzey fonksiyonelleştirilir.
Burada, aynı çekirdeğe sahip ve kaplamada farklılık gösteren iki tür nanopartikül değerlendirilir. Çekirdek, hızlı ve yüksek verimli mikrodalga tabanlı bir teknik kullanılarak sentezlenmiştir. Karşılaştırılan iki kaplama, biyomedikal uygulamalarda en çok kullanılanlardan biri olan sitrik asit29,30ve poliakrilik asitten (PAA), çok sayıda şelatlama fonksiyonuna sahip polimerik bir kaplamadan oluşur. VSM manyetometri ölçümleri daha sonra önce hücreler tarafından nanopartikül alımını ölçmek için, daha sonra kök hücrelerde içselleştirme üzerine nanopartikül yapısal bütünlüğünün doğrudan bir değerlendirmesi olarak kullanılır. Sonuçlar, inkübasyon konsantrasyonunun nanopartikül alımını etkilediğini ve kaplamanın bozulmalarını etkilediğini ve PAA’nın çok sayıda ankraj molekülünün çekirdeği bozulmaya karşı koruduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hızlı ve verimli bir mikrodalga bazlı sentez kullanılarak, manyetik nanopartiküller kolayca sentezlenebilir, kontrollü boyutta ve verilen moleküllerle daha fazla kaplanabilir. Kritik bir adım, küçük bir dağılım sağlamak için demir tuzunu ve benzil alkolü vakum altında stoklamaktır. Benzil alkol hem çözücü hem de ligand olarak hareket eder ve ek ligandlara ihtiyaç duymadan doğrudan kalibre edilmiş çıplak demir oksit elde etmeyi sağlar. Nanopartiküller suya transfer edildikten sonra çıplak m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Avrupa Birliği (ERC-2014-CoG projesi MaTissE #648779) tarafından desteklendi. Yazarlar, Paris 13 Üniversitesi’nin CNanoMat fiziko-kimyasal karakterizasyon platformunu kabul etmek istiyor.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the “hot-spot” effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles – The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
