Preparazione di estratti cellulari mediante criogrinding in un congelatore automatizzato

Summary

Descriviamo un metodo affidabile per la preparazione di estratti interi di cellule da lievito o altre cellule utilizzando un congelatore criogenico che riduce al minimo la degradazione e la denaturazione delle proteine. Gli estratti cellulari sono adatti per la purificazione di complessi proteici funzionali, analisi proteomiche, studi di co-immunoprecipitazione e rilevamento di modifiche proteiche labili.

Abstract

La facilità della manipolazione genetica e la forte conservazione evolutiva dei macchinari cellulari eucarioti nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae ne hanno fatto un organismo modello genetico preminente. Tuttavia, poiché un efficiente isolamento proteico dipende da un’interruzione ottimale delle cellule, l’uso del lievito per l’analisi biochimica delle proteine cellulari è ostacolato dalla sua parete cellulare che è costosa da digerire enzimaticamente (usando liticase o zimolyasi) e difficile da interrompere meccanicamente (usando un battitore di perline tradizionale, una pressa francese o un macinino da caffè) senza causare il riscaldamento dei campioni, che a sua volta causa denaturazione e degradazione delle proteine. Sebbene la macinazione manuale di cellule di lievito sotto azoto liquido (LN₂₎utilizzando malta e pestello eviti il surriscaldamento dei campioni, è ad alta intensità di manodopera e soggetta a variabilità nella lisi cellulare tra operatori. Da molti anni prepariamo con successo estratti di lievito di alta qualità utilizzando il criogrinding delle cellule in un congelatore automatizzato. La temperatura di -196 °C raggiunta con l’uso di LN₂ protegge il materiale biologico dalla degradazione mediante proteasi e nucleasi, consentendo il recupero di proteine intatte, acidi nucleici e altre macromolecole. Qui descriviamo questa tecnica in dettaglio per le cellule di lievito in erba che comporta prima il congelamento di una sospensione delle cellule in un tampone di lisi attraverso la sua aggiunta a goccia in LN₂ per generare goccioline congelate di cellule note come “popcorn”. Questo popcorn viene quindi polverizzato sotto LN₂ in un congelatore per generare un estratto “in polvere” congelato che viene scongelato lentamente e chiarificato dalla centrifugazione per rimuovere i detriti insolubili. Gli estratti risultanti sono pronti per applicazioni a valle, come la purificazione di proteine o acidi nucleici, analisi proteomiche o studi di co-immunoprecipitazione. Questa tecnica è ampiamente applicabile per la preparazione di estratti cellulari da una varietà di microrganismi, tessuti vegetali e animali, campioni marini tra cui coralli, nonché per isolare DNA / RNA da campioni fossili forensi e permafrost.

Introduction

Il lievito è un organismo modello popolare per gli studi sulle proteine, in quanto è un semplice organismo eucariotico con un’abbondanza di strumenti genetici e biochimici disponibili per i^{ricercatori 1}. A causa della loro robusta parete cellulare, una sfida che i ricercatori devono affrontare è quella di lysing efficiente le cellule senza danneggiare il contenuto cellulare. Sono disponibili diversi metodi per ottenere estratti proteici attraverso l’interruzione delle cellule di lievito che includono lisi enzimatica (zymolyase)^2,3,lisi^{chimica 4,}lisi fisica mediante congelamento-disgelo^5,a base di pressione (pressa francese)^6,7,meccanica (perline di vetro, macinino da caffè)^8,9,a base di sonicazione¹⁰ e criogenica^2,11. L’efficienza della lisi cellulare e la resa proteica possono variare considerevolmente a seconda della tecnica utilizzata, influenzando così il risultato finale o l’idoneità all’applicazione a valle desiderata per il lisato. Quando si studiano proteine instabili, con fugaci modifiche posttraslazionali o sensibili alla temperatura, è particolarmente importante utilizzare un metodo che riduca al minimo la perdita o la degradazione del campione durante la preparazione.

Tecnica di preparazione dell’estrazione	Dettagli	Vantaggi	Svantaggi	Analisi a valle	Riferimento
Stampa francese: Omogeneizzatore ad alta pressione (aka Microfluidizer) con pretrattamento enzimatico con Zymolyase	Zymolyase-20T, un omogeneizzatore ad alta pressione Microfluidizer. Il disgregatore è costituito da una pompa ad alta pressione azionata dall’aria (rapporto 1:250; pressione dell’aria richiesta 0,6-l MPa) e da una speciale camera di interruzione con un’unità di controtezione aggiuntiva. Per l’elaborazione è richiesta una dimensione minima del campione di 20 mL.	L’interruzione totale finale ottenuta utilizzando il protocollo combinato si è avvicinata al 100 % con 4 passaggi a una pressione di 95 MPa, contro solo il 32 % di interruzione con 4 passaggi a 95 MPa utilizzando solo l’omogeneizzazione senza Zymolyase.	Non adatto per applicazioni su piccola scala. Gli enzimi possono diventare costosi per i preparati su larga scala.	Purificazione delle proteine	6
Battitore di perline: Cellule trattate con zymolyase con perline di vetro in uno strumento fastprep	All’incirca un volume uguale di perline di vetro fredde, secche e lavate con acido da 0,5 mm viene aggiunto a un dato volume di pellet cellulare nel tampone di lysis e le cellule vengono interrotte da un’agitazione manuale vigorosa.	È particolarmente utile quando si realizzano estratti da molte piccole colture di lieviti diversi per scopi di dosaggio piuttosto che per la purificazione delle proteine.	Durante la procedura di perline di vetro, le proteine vengono trattate duramente causando un’ampia schiuma che porta alla denaturazione proteica. La quantità di rottura cellulare varia, mentre la proteolisi e la modifica delle proteine possono derivare dal riscaldamento dell’estratto sopra i 4 °C durante la rottura meccanica.	Principalmente analisi di DNA e RNA, ma anche analisi proteiche denaturando l’elettrofeoresi del gel, con o senza macchia occidentale.	8
Trattamento con zymolyase seguito da lisi usando una combinazione di shock osmotico e omogeneizzazione delle dounce	Dopo la digestione enzimatica delle pareti cellulari, gli sferoplasti vengono lalizzato con da 15 a 20 colpi di un pestello aderente (gioco da 1 a 3 μm) in un omogeneizzatore Dounce.	Vantaggioso utilizzare ceppi carenti di proteasi come BJ926 o EJ101. Questo è il modo più delicato per rompere le cellule di lievito e quindi è più adatto per preparare estratti che possono svolgere complesse funzioni enzimatiche (ad esempio, traduzione, trascrizione, replicazione del DNA) e in cui deve essere mantenuta l’integrità delle strutture macromolecolari (ad esempio ribosomi, splicesomes). È anche utile per isolare nuclei intatti che possono essere utilizzati per studi sulla cromatina (Bloom and Carbon, 1982) o per estratti di proteine nucleari (Lue e Kornberg, 1987).	I principali svantaggi della procedura di lisi sferoplasta sono che è relativamente noioso e costoso, specialmente per i preparati su larga scala (>10 litri), e i lunghi periodi di incubazione possono portare a proteolisi o modifica delle proteine.  Per i preparati di cromatina, sembrano essere di qualità variabile o inferiore rispetto a quelli prodotti dalla centrifugazione differenziale (basata sull’integrità della scala nucleosoma).	Isolando nuclei intatti per studi sulla cromatina, estratti in grado di svolgere complesse funzioni enzimatiche, estratti che richiedono l’integrità di strutture macromolecolari, estratti di proteine nucleari.	2
Interruzione cellulare delle cellule congelate flash mediante macinazione in azoto liquido utilizzando una malta / pestello o un frullatore	Le cellule vengono congelate immediatamente in azoto liquido e quindi lisciviate macinando manualmente in un mortaio usando un pestello o utilizzando un frullatore Waring in presenza di azoto liquido.	Il protocollo è facile e veloce. Può ospitare diverse quantità di cellule di lievito tra cui colture molto grandi. Il suo principale vantaggio è che le cellule vengono prese immediatamente dallo stato di crescita attiva in azoto liquido (−196 °C), diminuendo le attività enzimatiche degradative come proteasi e nucleasi così come le attività che modificano le proteine (ad esempio fosfatasi e chinasi). È particolarmente adatto per la produzione di estratti interi da un’unica coltura di lievito per la purificazione di proteine su larga scala.	Un po’ disordinato e potenzialmente pericoloso per l’investigatore disattento. Piccoli campioni (cioè colture di lievito da 10 a 100 ml) non sono facilmente lavorabili perché non c’è abbastanza massa di grumi cellulari congelati per fratturarsi efficacemente nel frullatore. È dispendioso in termini di tempo elaborare singoli campioni e pulire l’apparecchiatura tra un utilizzo e l’altro.	Estratti interi da una singola coltura di lievito per la purificazione proteica su larga scala.	2
Autolisi, Mulino perline	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 giri/min / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Lisi rapida ed efficiente, soprattutto per la preparazione di estratti su piccola scala	La generazione di calore porta alla denaturazione e alla degradazione delle macromolecole. È necessaria l’attrezzatura per il battito delle perline.	Analisi su piccola scala.	10
Autolisi, Sonicazione	pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 giri/min, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potenza 80%	Le apparecchiature di sonicazione sono solitamente disponibili nella maggior parte delle istituzioni.	La generazione di calore porta alla denaturazione e alla degradazione delle macromolecole. Sono necessarie apparecchiature di sonicazione. La llisi lenta può richiedere più di 24 ore.	Preparazioni per pareti cellulari di lievito.
Processo di ebollizione e congelamento-disgelo	Non sono necessarie attrezzature specializzate se non un congelatore standard e un blocco di riscaldamento o un bagno d’acqua calda.	Efficiente, riproducibile, semplice ed economico.	La generazione di calore porta alla denaturazione e alla degradazione delle macromolecole.	Analisi del DNA da parte della PCR.	5

Tabella 1: Raffronto dei metodi disponibili per la preparazione degli estratti di lievito.

La criogrinding (nota anche come macinazione criogenica/fresatura criogenica) è comunemente utilizzata per recuperare acidi nucleici, proteine o sostanze chimiche da campioni sensibili alla temperatura in modo affidabile per analisi quantitative o qualitative. È stato utilizzato con successo per molteplici applicazioni in diversi campi tra cui biotecnologia, tossicologia, scienze^{forensi 12,13,}scienze ambientali, biologia^{vegetale 14} e scienze alimentari. L’isolamento delle macromolecole biologiche intatte di solito dipende criticamente dalla temperatura. Temperature estremamente basse assicurano che le proteasi e le nucleasi rimangano inattive, determinando un isolamento affidabile di proteine intatte, acidi nucleici e altre macromolecole per analisi successive. Infatti, un congelatore mantiene tipicamente una temperatura del campione di -196 °C (il punto di ebollizione di LN₂), riducendo così al minimo la denaturazione e la degradazione del DNA/RNA o delle proteine.

Il congelatore utilizza una camera di rettifica elettromagnetica che sposta rapidamente una barra metallica solida o un cilindro avanti e indietro all’interno di un flaconcino contenente il campione da polverizzare tra tappi di estremità in acciaio inossidabile. Lo strumento crea e inverte rapidamente un campo magnetico all’interno della camera di rettifica. Mentre il campo magnetico si sposta avanti e indietro, il magnete schiaccia il campione contro le spine ottenendo così il “criogrinding” e la polverizzazione dei popcorn. Il congelatore sostituisce malta e pestello e consente la lavorazione sequenziale di più campioni (o fino a 4 campioni più piccoli contemporaneamente) con elevata riproducibilità ed evita la variabilità da utente a utente associata alla rettifica manuale. Una volta elaborati i campioni, le estrazioni di cellule possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni downstream.

Protocol

1. Preparazione dei popcorn di lievito Coltivare cellule di lievito in 0,5 L di media YPD ad una densità di 1 x 107 cellule/mL. Contare le celle usando un contatore Coulter o qualsiasi altro mezzo. Cellule centrifughe per 10 min a 2.400 g e 4 °C. Lavare ogni campione una volta con 500 mL di acqua di 18 mega Ohm Milli-Q deionizzata ghiacciata. Pellet di resuspend in 15 mL di tampone di lisi ghiacciato [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerolo, con a…

Representative Results

Abbiamo confrontato due diversi metodi per la lisi cellulare del lievito, vale a dire la fresatura di perline di vetro a 4 °C e un metodo di criogrinding automatizzato a -196 °C, per valutare le proteine di recupero relative negli estratti cellulari preparati con entrambi i metodi. Per questo studio, abbiamo scelto di utilizzare un ceppo di lievito in erba YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] …

Discussion

Una limitazione dello studio delle proteine native dal lievito è lalisi inefficiente delle cellule di lievito a causa della loro dura parete cellulare. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi, il metodo più coerente ed efficiente nelle nostre mani è la criogrinding delle cellule di lievito che lampeggiano congelate come popcorn. Questo metodo consente la preparazione affidabile di estratti di cellule intere di alta qualità dal lievito in erba rispetto ad altri metodi dilisi. I risultati rappresentativi hanno di…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent