成人ラット尿膀胱からの一次ニューロンとグリアの分離と培養
1School of Pharmaceutical Sciences,Guangzhou University of Chinese Medicine, 2Dongguan & Guangzhou University of Chinese Medicine Cooperative Academy of Mathematical Engineering for Chinese Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine, 3School of Basic Medical Sciences,Guangzhou University of Chinese Medicine
Summary
このプロトコルは、一次ニューロンとラット膀胱からのグリア分離のための反復可能なプロトコルを確立し、さらなる細胞実験を試みる。
Abstract
下部尿路は、2つの主要な機能、すなわち、定期的な尿貯蔵およびミチュリションを有する。これらの機能は、中央および末梢神経調節を介して仲介されます。低尿路神経系に関する広範な研究が行われているが、ほとんどの研究は、原発性文化に焦点を当ててきた。このプロトコルは、スプレイグ-ドーリーラットからの膀胱ニューロンとグリアの分離と培養のための方法を導入します。この方法では、ニューロンおよびグリアを37°C、5%CO2インキュベーターで5〜7日間インキュベーターでインキュベートした。その結果、それらは関連する後続の免疫蛍光実験に適した成熟した形状に成長した。細胞は光学顕微鏡を用いて形態学的に観察した。ニューロン、シナプス小胞、およびグリアは、それぞれβ-III-管状およびMAP-2、シナプシン-1、およびGFAP染色によって同定された。一方、免疫細胞化学は、コリンアセチルトランスビセラーゼ、DYNLL2、SLC17A9などのいくつかの神経伝達物質関連タンパク質に対して行われました。
Introduction
下部尿路には、尿の定期的な保存と、1のミチュリンの2 つの機能があります。下部尿路神経系(LUTNS)はこれらの機能を制御し、繊細で多くの神経障害の影響を受けやすく、先天性(ポルフィリン症)、後発性疾患状態(糖尿病性膀胱障害)、薬物誘発(出血性膀胱炎)、または外傷(脊髄損傷)2,3,4,6,7, 7, 7, 7, 7, 7, 7,7, 7.生理学的/病理学的研究では、生体内およびインビトロ実験も同様に重要である。LUTNSに関するインビボ研究は、しばらくの間、臓器、細胞、および分子レベルで行われてきたが、尿膀胱からの一次ニューロンに関するインビトロ研究はほとんど存在しない8,9である。今回の研究は限られていますが、他の研究者が改善できるように、この分野の研究を開拓したいと考えています。このようにして、この共培養は、膀胱ニューロン機能不全などの表現型における生理学的機能不全の細胞的理解につながる可能性がある。
離散層への筋肉細胞の明確な方向性を持つ腸筋とは対照的に、膀胱の筋肉は組織化されていない10である。したがって、膀胱の外層を剥離する代わりに、この方法は、手術困難を低減し、高い細胞生存率のための前処理時間を短縮するために膀胱全体を消化することを提案する。
この方法に従って、ニューロンと他の細胞の混合培養を得ることができる。その存在は生体内環境11を模倣するので、他の細胞は不可欠である。また、このような細胞は、培地で利用できない物質を提供する。
この方法は、消化のための2つのステップを伴う。まず、コラゲザーゼII型は、コラーゲンを加水分解するために使用され、続いてトリプシンが、組織を細胞10に解化する。このようにして、膀胱組織は単一細胞に分散され、その後比較的独立して成長する。ニューロンの培養が成熟すると、ニューロンは、イメージングまたは機能的アッセイに使用することができます。
Protocol
すべての実験プロトコルと動物の手順は、国家研究評議会の倫理原則ガイドラインに準拠しています。 1. 材料の準備 実験を行う前に、オートクレーブを使用してすべての機器とddH2Oを殺菌します。器械は外科用はさみ、眼科用はさみ、鉗子、スプーン核の分け器、ガラス皿(直径60-100 mm)、およびガラスブレーカに限定されない。 以下のようにクレ?…
Representative Results
一次細胞培養の過程で、獲得した細胞は、付着状態の前に明るく明確な境界で丸くした。ニューロンが成長するにつれて、樹状突起と軸索は明確になり始めました。5~7日間培養した後、ニューロンは長い投影で成熟した形に達し、イメージングや機能研究に最適でした。不純物および細胞デブリの大部分は、メディアの変化により除去することができたが、ポリD-リジンおよびラミニンコー?…
Discussion
プレートの準備
免疫蛍光またはカルシウムイメージング実験用の6-、12、または48ウェル培養プレートでのガラスカバーリップの使用は、経済的でサンプル節約的な操作です。細胞は、一次細胞培養の調製中にカバースリップのないプレートでよく成長する。そのため、カバーリップは、ウェスタンブロットまたはポリメラーゼ連鎖反応などの実験で欠かせない。さらに、コー?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は中国国立自然科学財団(グラント81673676)と東莞科学技術局(グラント2019622101002)によって支援されました。著者らは、メアリーローズ・サリバン博士(ハーバード大学医学部外科助教授)に技術コンサルティングをしてくれたことに感謝している。
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
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Citer Cet Article
Wang, R., Huang, Z., Ren, W., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B., Huang, P., Cao, H. Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder. J. Vis. Exp. (159), e61177, doi:10.3791/61177 (2020).