Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

Summary

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Abstract

La differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali del topo (mESC) è un potenziale strumento per chiarire i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi e potenzialmente aiutare nella medicina rigenerativa. Qui, abbiamo stabilito un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dagli mESC invitro, utilizzando la strategia dello screening combinatorio. Nelle condizioni qui definite, la formazione del corpo embrionale di 2 giorni + il protocollo di induzione dell’acido retinoico di 6 giorni consente una differenziazione rapida ed efficiente dagli MESC alle cellule precursori neurali (NPC), come visto dalla formazione di derivati A2lox e 129 ben impilati e simili a neurite che sono positivi alla Nestin. Lo stato sano dei corpi embrioidi e il momento in cui viene applicato l’acido retinoico (RA), così come le concentrazioni di RA, sono fondamentali nel processo. Nella successiva differenziazione dai NPC ai neuroni, N2B27 medium II (integrato da mezzo neurobasale) potrebbe supportare meglio il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Il metodo presentato è altamente efficienza, a basso costo e facile da usare e può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.

Introduction

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono pluripotenti e possono differenziarsi in cellule precursori neurali (NPC) e successivamente in neuroni in determinate condizioni¹. La neurogenesi basata su ESC fornisce la migliore piattaforma per imitare la neurogenesi, fungendo così da strumento utile per gli studi di biologia dello sviluppo e potenzialmente aiutare nella medicina^{rigenerativa 2,3}. Negli ultimi decenni, sono state riportate molte strategie per indurre la neurogenesi embrionale, come il metodo transgenico^{4, utilizzando}piccole^{molecole 5,}utilizzando un microambiente a matrice 3D⁶e la tecnica di co-coltura⁷. Tuttavia, la maggior parte di questi protocolli sono condizioni limitate o difficili da usare, quindi non sono adatti per l’uso nella maggior parte dei laboratori.

Per trovare un metodo facile da usare e a basso costo per ottenere un’efficiente differenziazione neurale dagli MESC, qui è stata utilizzata una strategia di screening combinatorio. Come descritto nella figura 1, l’intero processo di neurogenesi embrionale è stato diviso in 2 fasi. La fase I si riferisce al processo di differenziazione dagli mESC ai PNG, e la fase II si riferisce alla successiva differenziazione dai PNG ai neuroni. Sulla base dei principi di facile funzionamento, basso costo, materiali facilmente disponibili e alta efficienza di differenziazione, sono stati scelti sette protocolli nella fase I e tre protocolli nella fase II in base al tradizionale sistema di coltura monostrato aderente o al sistema di formazione del corpo embrionale^8,9. L’efficienza di differenziazione dei protocolli in entrambe le fasi è stata valutata utilizzando l’osservazione della morfologia cellulare e il test di immunofluorescenza. Combinando il protocollo più efficiente di ogni fase, abbiamo stabilito il metodo ottimizzato per la differenziazione neurale dagli mESC.

Protocol

1. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo Preparare piatti o piatti di coltura cellulare ricoperti di gelatina 0,1%. Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% w/v in acqua) a piatti di coltura cellulare da 60 mm. Dondolare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle stoviglie di coltura cellulare. Mettere i piatti in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e lasciare il rivestimento per 1 h. Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0…

Representative Results

La formazione del corpo embrionale di 2 giorni + l’induzione ra di 6 giorni funziona meglio per dirigere la differenziazione degli MESC in NPC (Fase I). Per determinare il protocollo ottimale che promuove meglio la differenziazione degli MESC in NPC (fase I), sono stati testati 7 protocolli sia su A2lox che su 129 mESC(tabella 1)e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando il microscopio a luce. Come mostrato nella figura 3A, la maggior pa…

Discussion

Nel presente studio, abbiamo stabilito un metodo semplice ed efficace per la differenziazione neuronale dagli mESC, con materiali a basso costo e facilmente ostruibili. In questo metodo, 2 giorni di formazione del corpo embrionale seguiti da 6 giorni di induzione ra possono promuovere efficacemente la differenziazione degli MESC in NPC (protocollo di fase I 3). Per la differenziazione di fase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induce più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni. Per garantire il succe…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650