מטרת הפרוטוקול היא להשוות בין תנאי ציפוי שונים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי להעריך כיצד ציפוי דיפרנציאלי משפיע על קצב הצמיחה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). בפרט, אנו שואפים ליצור תנאים להשגת צמיחה אופטימלית של תרביות iPSC.
מחקר זה מתמקד בהבנת האופן שבו גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים על מצעי ציפוי ECM שונים יכול להשפיע על מפגש התאים. פרוטוקול להערכת מפגש iPSC בזמן אמת נקבע ללא צורך לספור תאים בתרחיף של תא בודד כדי למנוע כל הפרעה בגדילה. מערכת ניתוח תמונות בעלת תוכן גבוה שימשה להערכת מפגש iPCS על 4 ECMs שונים לאורך זמן באופן אוטומטי. הגדרות ניתוח שונות שימשו להערכת מפגש תאים של iPSCs דבקים ורק הבדל קל (ב 24 ו 48 שעות עם laminin) נצפתה אם מסכה 60, 80 או 100% הוחל. אנו גם מראים כי laminin להוביל את המפגש הטוב ביותר לעומת Matrigel, vitronectin ו fibronectin.
תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתקבלים מתאים סומטיים וניתן למיין אותם לסוגי תאים שונים. הם משמשים לעתים קרובות כמערכת למודל פתוגנזה של מחלות או לביצוע בדיקת תרופות, וגם מציעים את הפוטנציאל לשמש בהקשר של רפואה מותאמת אישית. מאז iPSCs יש פוטנציאל גדול, חשוב לאפיין אותם באופן מלא לשימוש כמערכת מודל אמין. בעבר הראינו את החשיבות של גידול תאי גזע פלוריפוסיים בסביבה היפוקסית, שכן תאים אלה מסתמכים על גליקוליזה וסביבה אירובית עלולה לגרום לחוסר איזון חמצון-חיזור1. תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים פגיעים גם לתנאי תרבית אחרים, במיוחד לסביבה החוץ-תאית. אופטימיזציה של תנאי התרבות היא נושא מרכזי כדי לשמור עליהם בריאים ומתרבים. תרבית iPSC בריאה תוביל לתאים ממוינים בריאים שהם בדרך כלל נקודת הקצה של המודל המשמש להבנת תכונות מולקולריות, תאיות ותפקודיות של הפרעות אנושיות ספציפיות או תהליכים תאיים.
במחקר זה, נעשה שימוש בפרוטוקול פשוט כדי לבדוק את המפגש של iPSCs באמצעות תנאי ציפוי שונים בבארות נפרדות. תאי גזע פלוריפוטנטיים דורשים שכבה מזינה של פיברובלסטים עובריים (MEF) כדי להתחבר כראוי, אך הדו-קיום של תאי גזע פלוריפוטנטיים ו-MEF מקשה על ביצוע אנליזה כמו RNA או מיצוי חלבונים מכיוון שקיימות שתי אוכלוסיות של תאים. על מנת להימנע משכבת ההזנה, חלבונים שונים השייכים למטריצה החוץ-תאית (ECM) שימשו כדי ליצור מחדש את נישת התאים הטבעית וכדי לקבל תרבית iPSC ללא הזנה. בפרט, Matrigel הוא תכשיר ממברנת מרתף מסולפת המופק מסרקומה של עכבר אנגלברט-הולם-נחיל (EHS), המועשרת בחלבוני מטריצה חוץ-תאית (כלומר, למינין, קולגן IV, פרוטאוגליקנים של הפראן סולפט, אנטקטין/נידוג’ן וגורמי גדילה)2,3. תנאי הציפוי האחרים המשמשים הם במקום זאת חלבונים מטוהרים עם רלוונטיות ידועה בבניית ה- ECMs: laminin-521 ידוע כמופרש על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) במסת התא הפנימית של העובר והוא אחד הלמינינים הנפוצים ביותר בגוף לאחר הלידה 4,5,6,7,8,9, 10,11; ויטרונקטין הוא מטריצת תרבית תאים נטולת קסנו-קסנו, הידועה כתומכת בצמיחה ובהתמיינות של hPSC 12,13,14,15,16; פיברונקטין הוא חלבון ECM החשוב להתפתחות בעלי חוליות ולחיבור ותחזוקה של תאי גזע עובריים במצב פלוריפוטנטי 17,18,19,20,21,22,23,24,25. מכיוון שתנאי ציפוי שונים זמינים, אנו משווים אותם מבחינת השפעתם על מפגש ה-iPSCs.
השימוש ב- iPSCs למידול מחלות ובדיקת תרופות עתידיות יחד עם היישום האפשרי שלהם ברפואה מדויקת הופכים אותה לטכנולוגיה בעלת רלוונטיות רבה ומסיבה זו אנו מאמינים כי יש צורך להבין בבירור את מצב התרבות במבחנה הדומה יותר למצב הפיזיולוגי של תאי גזע עובריים. בהקשר זה, בדקנו ציפויי ECM שונים באמצעות iPSCs מס…
The authors have nothing to disclose.
המחקר נתמך על ידי מענקים ממשרד הבריאות האיטלקי פונדציונה במבינו גסו (Fondazione Bambino Gesù) ורייסרקה קורנטה (Ricerca Corrente) ל-C.C. ברצוננו להודות לד”ר אנריקו ברתיני (המחלקה למדעי המוח, היחידה למחלות נוירומוסקולריות ונוירודגנרטיביות, המעבדה לרפואה מולקולרית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ד”ר סטפניה פטריני (מתקן ליבה למיקרוסקופיה קונפוקלית, מעבדות מחקר, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ג’וליה פריקולי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, גנים ותרפיה תאית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) ורוברטה פרטי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, טיפול גנטי ותאי, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) לדיונים מדעיים ועזרה טכנית. מריה וינצ’י זכתה ב”מלגת ילדים חולי סרטן בבריטניה”.
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
H2O | MILLIQ | ||
Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |