自動イメージングシステムを用いたiPS細胞の合流点の測定
Summary
このプロトコルの目的は、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)コーティング条件を比較して、差動コーティングが人工多能性幹細胞(iPSC)の増殖速度にどのように影響するかを評価することです。特に、iPS細胞培養の最適な増殖を得るための条件設定を目指しています。
Abstract
この研究は、異なるECMコーティング基板上でiPS細胞を増殖させることが細胞のコンフルエントにどのように影響するかを理解することに焦点を当てています。iPS細胞コンフルエンスをリアルタイムで評価するプロトコルが確立されており、増殖の摂動を避けるために単一細胞懸濁液中の細胞をカウントする必要はありません。ハイコンテント画像解析システムを使用して、4つの異なるECMのiPCS合流を経時的に自動的に評価しました。接着性iPS細胞の細胞コンフルエンスを評価するために異なる分析設定が使用され、60、80、または100%のマスクが適用されたかどうかは、わずかな違い(ラミニンで24時間および48時間)のみが観察されました。また、ラミニンがマトリゲル、ビトロネクチン、フィブロネクチンと比較して最良のコンフルエントにつながることも示しています。
Introduction
人工多能性幹細胞(iPSC)は体細胞から得られ、異なる細胞型に分化することができる。それらは、疾患の病因をモデル化したり、薬物スクリーニングを実行したりするためのシステムとしてよく使用され、個別化医療のコンテキストで使用される可能性も提供します。iPS細胞は大きな可能性を秘めているため、信頼性の高いモデルシステムとして使用するために、iPS細胞を完全に特徴付けることが重要です。我々は以前、低酸素環境でiPS細胞を増殖させることの重要性を示しましたが、これらの細胞は解糖に依存しており、好気性環境は酸化還元の不均衡を引き起こす可能性があるためです1。iPS細胞は、他の培養条件、特に細胞外環境に対しても脆弱です。培養条件の最適化は、それらを健康で増殖させるための重要な問題です。健康なiPS細胞培養は、特定のヒト疾患または細胞プロセスの分子、細胞および機能的特徴を理解するために使用されるモデルのエンドポイントである健康な分化細胞につながります。
この研究では、簡単なプロトコルを使用して、別々のウェルで異なるコーティング条件を使用してiPS細胞の合流点をテストしました。iPS細胞は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)を適切に付着させるためにフィーダー層を必要としますが、iPS細胞とMEFが共存しているため、2つの細胞集団が存在するため、RNAやタンパク質抽出などの解析が困難です。フィーダー層を回避するために、細胞外マトリックス(ECM)に属するさまざまなタンパク質を使用して、天然の細胞ニッチを再現し、フィーダーフリーのiPS細胞培養を行ってきました。特に、マトリゲルは、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜製剤であり、細胞外マトリックスタンパク質(ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン/ニドゲン、成長因子)が豊富に含まれています2,3。他の使用されるコーティング条件は、代わりにECMの構築に既知の関連性を有する精製タンパク質である:ラミニン-521は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)によって胚の内部細胞塊に分泌されることが知られており、出生後の体内で最も一般的なラミニンの1つである4,5,6,7,8,9、10,11;ビトロネクチンは、hPSC 12,13,14,15,16の増殖と分化をサポートすることが知られているゼノフリー細胞培養マトリックスです。フィブロネクチンは、脊椎動物の発生および多能性状態の胚性幹細胞の付着および維持に重要なECMタンパク質である17、18、19、20、21、22、23、24、25。異なるコーティング条件が利用できるため、iPS細胞の合流性への影響の観点からそれらを比較します。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPS細胞は、疾患モデリングや将来の創薬スクリーニングに利用され、精密医療への応用も視野に入れており、胚性幹細胞の生理的状況により近いin vitro培養条件を明確に理解する必要があると考えています。これに関連して、細胞が健康で未分化な状態を維持できる条件を理解するために、野生型iPS細胞を使用してさまざまなECMコーティングをテストしました。これに加えて、重要な点は、ME…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Fondazione Bambino GesùおよびRicerca Corrente(イタリア保健省)からC.C.への助成金によって支援されました。 エンリコ・ベルティーニ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院分子医学研究所神経筋・神経変性疾患ユニット神経科学部)、ステファニア・ペトリーニ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院研究所共焦点顕微鏡中核施設)、ジュリア・ペリコリ博士(バンビーノ・ジェズ小児研究病院腫瘍血液学・遺伝子・細胞治療科) ロベルタ・フェレッティ(腫瘍血液学、遺伝子および細胞療法、小児研究病院バンビーノジェズ)の 科学的議論と技術的支援。マリアヴィンチは、「小児がん英国フェローシップ」の受賞者です。
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
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