Måling av sammenløpet av iPSC-er ved hjelp av et automatisert bildebehandlingssystem.
Summary
Målet med protokollen er å sammenligne forskjellige ekstracellulære matriksbeleggforhold (ECM) for å vurdere hvordan differensialbelegg påvirker vekstraten til induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Spesielt tar vi sikte på å sette opp forhold for å oppnå optimal vekst av iPSC-kulturer.
Abstract
Denne studien fokuserer på å forstå hvordan voksende iPSC-er på forskjellige ECM-beleggsubstrater kan påvirke cellekonfluens. En protokoll for å vurdere iPSC-sammenløp i sanntid er etablert uten behov for å telle celler i enkeltcellesuspensjon for å unngå vekstforstyrrelser. Et bildeanalysesystem med høyt innhold ble brukt til å vurdere iPCS-sammenløp på 4 forskjellige ECM-er over tid på en automatisert måte. Ulike analyseinnstillinger ble brukt til å vurdere cellekonfluens av adherente iPSC, og bare en liten forskjell (ved 24 og 48 timer med laminin) er observert om en 60, 80 eller 100% maske ble påført. Vi viser også at laminin fører til best samløp sammenlignet med Matrigel, vitronektin og fibronektin.
Introduction
Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er hentet fra somatiske celler og kan differensieres i forskjellige celletyper. De brukes ofte som et system for å modellere sykdomspatogenese eller utføre narkotikascreening, og tilbyr også potensialet til å bli brukt i sammenheng med personlig medisin. Siden iPSC-er har stort potensial, er det viktig å karakterisere dem fullt ut for bruk som et pålitelig modellsystem. Vi har tidligere vist viktigheten av å dyrke iPSC-er i et hypoksisk miljø, da disse cellene er avhengige av glykolyse og et aerobt miljø kan forårsake redoks ubalanse1. iPSC-er er også sårbare for andre kulturforhold, spesielt det ekstracellulære miljøet. Optimalisering av kulturforhold er et sentralt tema for å holde dem sunne og spredende. En sunn iPSC-kultur vil føre til sunne differensierte celler som generelt er endepunktet for modellen som brukes til å forstå molekylære, cellulære og funksjonelle trekk ved spesifikke menneskelige lidelser eller cellulære prosesser.
I denne studien har en enkel protokoll blitt brukt til å teste sammenløpet av iPSC-er ved hjelp av forskjellige beleggforhold i separate brønner. iPSCs krever et materlag av murine embryonale fibroblaster (MEF) for å festes riktig, men sameksistensen av iPSCs og MEF gjør det vanskelig å utføre analyser som RNA eller proteinekstraksjon siden to populasjoner av celler er tilstede. For å unngå materlaget har forskjellige proteiner som tilhører den ekstracellulære matrisen (ECM) blitt brukt til å gjenskape den naturlige cellenisjen og å ha materfri iPSC-kultur. Spesielt er Matrigel et løselig kjellermembranpreparat ekstrahert fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) musesarkom, som er beriket i ekstracellulære matriksproteiner (dvs. laminin, kollagen IV, heparansulfatproteoglykaner, entactin / nidogen og vekstfaktorer)2,3. De andre brukte beleggforholdene er i stedet rensede proteiner med kjent relevans i byggingen av ECM-ene: laminin-521 er kjent for å bli utskilt av humane pluripotente stamceller (hPSCs) i embryoets indre cellemasse, og det er en av de vanligste lamininene i kroppen etter fødselen 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin er en xenofri cellekulturmatrise kjent for å støtte vekst og differensiering av hPSC 12,13,14,15,16; fibronektin er et ECM-protein som er viktig for virveldyrutvikling og vedlegg og vedlikehold av embryonale stamceller i en pluripotent tilstand 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Siden forskjellige beleggforhold er tilgjengelige, sammenligner vi dem når det gjelder deres effekt på iPSCs sammenløp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruken av iPSC for sykdomsmodellering og fremtidig legemiddelscreening sammen med deres mulige anvendelse i presisjonsmedisin gjør det til en teknologi av stor relevans, og av denne grunn tror vi at det er nødvendig å tydelig forstå in vitro-dyrkingstilstanden som bedre ligner den fysiologiske situasjonen til embryonale stamceller. I denne sammenheng testet vi forskjellige ECM-belegg ved hjelp av villtype iPSCs for å forstå forholdene som tillater cellene å forbli i en sunn og utifferentiert tilstand. I tillegg ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av tilskudd fra Fondazione Bambino Gesù og Ricerca Corrente (det italienske helsedepartementet) til C.C. Vi vil gjerne takke Dr Enrico Bertini (Institutt for nevrovitenskap, Enhet for nevromuskulære og neurodegenerative sykdommer, Laboratorium for molekylærmedisin, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Dr Stefania Petrini (Confocal Microscopy Core Facility, Research Laboratories, Bambino Gesù Children’s Research Hospital), Giulia Pericoli (Institutt for onco-hematologi, Gen- og celleterapi, Children’s Research Hospital Bambino Gesù) og Roberta Ferretti (Institutt for onco-hematologi, gen- og celleterapi, Children’s Research Hospital Bambino Gesù) for vitenskapelige diskusjoner og teknisk hjelp. Maria Vinci er mottaker av et “Children with Cancer UK fellowship”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimie. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochimie. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
