متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة
Summary
ويرد وصف لطريقة متوازية للغاية لقياس الانقسام الموقع محددة من الحمض النووي في مستوى جزيء واحد. يوضح هذا البروتوكول الأسلوب باستخدام NdeI قيد endonuclease. يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة لدراسة أي عملية تؤدي إلى شق الحمض النووي في الموقع.
Abstract
إن شق الحمض النووي الخاص بالموقع (SSDC) هو خطوة رئيسية في العديد من العمليات الخلوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتحرير الجينات. يصف هذا العمل اختبارًا حركيًا قادرًا على قياس SSDC في العديد من جزيئات الحمض النووي الفردية في وقت واحد. يتم إعداد DSNrate الركيزة المربوطة، وتحتوي كل منها على نسخة واحدة من التسلسل المستهدف، في قناة تدفق ميكروفلويديك. المغناطيس الخارجي ينطبق قوة ضعيفة على الخرز paramagnetic. يمكن مراقبة سلامة ما يصل إلى 1000 DNAs الفردية من خلال تصور الميكروبات تحت التصوير darkfield باستخدام حقل واسع ، هدف التكبير المنخفض. حقن endonuclease تقييد، NdeI، يبدأ رد فعل الانقسام. يستخدم المجهر الفيديو لتسجيل اللحظة الدقيقة لكل انشقاق الحمض النووي من خلال مراقبة الإطار الذي يتحرك فيه الخرزة المرتبطة لأعلى وخارج المستوى البؤري للهدف. يحدد عد حبة الإطار حسب الإطار مقدار التفاعل، ويحدد الاحتواء الأسي معدل التفاعل. هذه الطريقة تسمح بجمع البيانات الكمية والناحصة إحصائيا على جزيء واحد SSDC التفاعلات في تجربة واحدة.
Introduction
إن شق الحمض النووي الخاص بالموقع (SSDC) هو خطوة رئيسية في العديد من المعاملات الجينومية. على سبيل المثال، تحمي أنظمة التقييد البكتيرية -التعديل (RM)1 و CRISPR2 الخلايا من الهجوم بواسطة phages و plasmids من خلال التعرف على الحمض النووي الأجنبي وشقه في تسلسلات محددة. في النوع الثاني RM، تقييد endonucleases (REs) التعرف على قصيرة 4-8 قاعدة الزوج (bp) تسلسلات عبر البروتين النووي التفاعلات حمض3. ترتبطوريس المرتبطة بـ CRISPR، مثل Cas9، بالمواقع عبر تهجين الموقع المستهدف مع ربط crRNAs إلى endonucleases4. إنشاء موقع محدد فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DSBs) هي أيضا الخطوة الأولى في العديد من أحداث إعادة التهيئة DNA5. على سبيل المثال، يتطلب تنوع مناطق ربط المستضدات التي أنشأها إعادة التركيب V(D)J الاعتراف وشق مواقع مستهدفة محددة6. ومن المعروف أن بعض transposons لاستهداف تسلسلات الحمض النووي محددة, وكذلك7. ليس من المستغرب أن العديد من النوى الخاصة بالموقع التي تشارك في هذه العمليات ، مثل Cas9 ، هي مكون رئيسي لتقنيات تحرير الجينات8. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا تصميم رواية endonucleases موقع محدد (أي، زنك النيوكلاليس إصبع9 و تالنس10)كما تم تصميمها لتحرير الجينوم.
وقد استخدمت العديد من الأساليب لقياس حركة شق الموقع المحدد للأحماض النووية. وتشمل هذه التحليل هلام، fluorescence11،12، والتسلسل على أساس الأساليب13. وقد تحقق تقدم كبير مع ربط الميكروبات ، والذي يسمح DSBs في جزيئات واحدة من الحمض النووي ليتم الكشف عنها من قبل حركة حبة بعد فصل حبلا. في هذه الأساليب، يتم استخدام أنواع مختلفة من القوات لضمان فصل حبلا والحركة من الخرزة ما بعد الانقسام. في حالة واحدة، وقد استخدمت الفخاخ البصرية لقياس الانقسام من الحمض النووي من قبل EcoRV14. في هذه التجارب، البحث الهدف هو الهدف من التحقيق، مع الشروط الأمثل بحيث ربط موقع معين هو معدل الحد من الخطوة. عيب واحد من الفخاخ البصرية هو أنه يمكن ملاحظة الحمض النووي واحد فقط في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تطبيق قوة سحب كبيرة دورية لاختبار فصل حبلا.
تقنية أخرى يستخدم مزيج من تدفق وضعف القوى المغناطيسية لسحب على حبة بطريقة مستمرة15. وبهذه الطريقة، يتم قياس الانقسام الانتشار المحدود بواسطة NdeI. وتسمح الطريقة المستخدمة بالقياس المتزامن لعدة مئات من السنوات من النايـزات DNN في آن واحد، مما يتيح تحقيق الأهمية الإحصائية في تجربة واحدة. كما استخدمت التجارب القائمة على ملاقط مغناطيسية. في إحدى هذه الدراسات، تمت دراسة إنتيجراس فيروسي من خلال تضمين DSB في أوليجونوكليوتيد16. نتج عن الاندماج الناجح دمج DSB في الحمض النووي المربوط وفقدان الخرزة المرفقة. وفي دراسة مماثلة للنوع الثالث المعتمد على ATP للاندليس Endonuclease EcoPI، لوحظ عشرات من DN أنياب في تجربة واحدة17. ملاقط المغناطيسي عقد ميزة أن التوتر، فضلا عن حلقات الحمض النووي، يمكن السيطرة عليها ورصدها أثناء التفاعل.
تظهر هنا طريقة جزيء واحد متوازي للغاية لقياس حركية SSDC ، والتي تستفيد من التحسينات الحديثة في الربط على نطاق واسع من DN. هذا الأسلوب هو تحسين وتمديد الطرق السابقة المستخدمة لقياس النسخ المتماثل الحمض النووي18، طول كفاف من الحمض النووي19، والانقسام بواسطة REs15. في هذه التقنية، يتم إعداد DNAs الخطية التي تحتوي على نسخة واحدة من تسلسل التعرف مع البيوتين في نهاية واحدة وdidoxigenin في الطرف الآخر. يربط البيوتين streptavidin ، الذي يرتبط بشكل مُت بارادييدي شبه مُجَاَنِي. يتم حقن مجمعات حبة الحمض النووي في قناة microfluidic التي تم وظيفية مع شظايا مضادة للحفرية. ثم الحبال الحمض النووي إلى نقاط مرفق السطح عن طريق ربط digoxigenin لشظايا القوات المسلحة البوروندية الممزتزة. القوى المغناطيسية ضعيفة تطبيقها مع المغناطيس الدائم الحفاظ على حبة من التمسك غير على وجه التحديد إلى السطح. يمكن حقن العينات بسرعة (< 30 s) في قناة التدفق لتنشيط تفاعل الانقسام. يتم إيقاف تشغيل التدفق أثناء تجميع البيانات. كما هو مشقوق كل الحمض النووي، يمكن تحديد الوقت الدقيق للشق عن طريق تسجيل الإطار الذي يتحرك الخرز صعودا وخارج خطة التنسيق من الهدف، وبالتالي تختفي من سجل الفيديو. ويمكن استخدام عدد الإطارات حسب الإطارات من الخرز المتبقية لقياس التقدم في التفاعل.
ويرد أدناه البروتوكول الكامل وكذلك البيانات التي تم جمعها باستخدام NdeI. وكمثال على كيفية تطبيق هذه التقنية، يتم قياس معدلات الانقسام لمجموعة من تركيزات البروتين في تركيزين مختلفين من المغنيسيوم، وهو عامل مساعد معدني أساسي. على الرغم من أن هذا التطبيق للبروتوكول يستخدم NdeI، يمكن تكييف الأسلوب للاستخدام مع أي نواة خاصة بالموقع عن طريق تغيير تصميم الركيزة الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن استخدام البروتوكول لقياس حركية أي نظام SSDC، شريطة أن يتم ملاحظة فصل الخيوط أثناء التجربة. يتأثر الكشف عن الانقسام من خلال مراقبة انفصال الخرز المربوط ، وبالتالي يمثل لحظة انفصال حبلا. تحدث كافة الخطوات السابقة قبل الكشف عن الانقسام; وهكذا، يتم تسجيل وقت العبور الإجمالي فقط.
<p class="jov…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم منحة MCB-1715317.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
References
- Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Sadowski, P. D. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).
- Schatz, D. G. Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase. Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).
- Gori, J. L., et al. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease. Biochimie. 28 (19), 7879-7888 (1989).
- Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease. Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).
- Becker, W. R., et al. High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2. Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).
- vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).
- Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- van Aelst, K., et al. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).
- Williams, K., et al. A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates. American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).
- Song, D., et al. Tethered particle motion with single DNA molecules. American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).
- Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis. Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).
- Piatt, S., Price, A. C. Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments. PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).
