Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site
Summary
Une méthode très parallèle pour mesurer le clivage spécifique au site de l’ADN au niveau de la molécule unique est décrite. Ce protocole démontre la technique utilisant la restriction endonuclease NdeI. La méthode peut facilement être modifiée pour étudier n’importe quel processus qui aboutit à un clivage d’ADN spécifique au site.
Abstract
Le clivage d’ADN spécifique au site (SSDC) est une étape clé dans de nombreux processus cellulaires, et il est crucial pour l’édition de gènes. Ce travail décrit un test cinétique capable de mesurer SSDC dans de nombreuses molécules d’ADN unique simultanément. Les ADN de substrat attachés aux perles, contenant chacun une seule copie de la séquence cible, sont préparés dans un canal de flux microfluidique. Un aimant externe applique une force faible aux perles paramagnétiques. L’intégrité de jusqu’à 1 000 DNA individuels peut être surveillée en visualisant les microbilles sous l’imagerie darkfield à l’aide d’un objectif de grossissement à large champ et faible. L’injection d’une endonuclease de restriction, NdeI, initie la réaction de clivage. La microscopie vidéo est utilisée pour enregistrer le moment exact de chaque clivage d’ADN en observant le cadre dans lequel la perle associée se déplace de haut en haut du plan focal de l’objectif. Le comptage des perles image par image quantifie la réaction, et un ajustement exponentiel détermine le taux de réaction. Cette méthode permet la collecte de données quantitatives et statistiquement significatives sur les réactions de la SSDC à molécule unique dans une seule expérience.
Introduction
Le clivage d’ADN spécifique au site (SSDC) est une étape clé dans de nombreuses transactions génomiques. Par exemple, les systèmes de modification des restrictions bactériennes (RM)1 et CRISPR2 protègent les cellules contre les attaques par les phages et les plasmides en reconnaissant et en coupant l’ADN étranger à des séquences spécifiques. Dans le type II RM, les endonuclées de restriction (RE) reconnaissent les courtes séquences de paires de base (bp) de 4 à 8 par l’intermédiaire d’interactions protéine-nucléique3. Les endonucléles associés à CRISPR, tels que Cas9, se lient aux sites par hybridation du site cible avec des crRNA liés aux endonucléases4. La création de ruptures à double brin spécifiques au site (DSB) sont également la première étape dans de nombreux événements de recombinaison de l’ADN5. Par exemple, la diversité des régions liant les antigènes créées par la recombinaison V(D)J nécessite la reconnaissance et le clivage de sites cibles spécifiques6. Certains transposons sont connus pour cibler des séquences d’ADN spécifiques, ainsique 7. Il n’est pas surprenant que de nombreuses nucléases spécifiques à un site impliquées dans ces processus, comme Cas9, constituent un élément clé des technologies d’édition génétique8. En outre, de nouvelles endonuclées spécifiques au site (c.-à-d. nucléases des doigts de zinc9 et TALENS10)ont également été conçues pour modifier les génomes.
De nombreuses méthodes ont été employées pour mesurer la cinétique du clivage spécifique au site des acides nucléiques. Il s’agit notamment de l’analyse du gel, de la fluorescence11,12et des méthodes basées sur le séquençage13. Un progrès majeur a été réalisé avec l’attachement des microbilles, qui permet aux DSBs dans des molécules simples de l’ADN d’être détectés par le mouvement d’une perle après séparation de brin. Dans ces méthodes, différents types de forces sont utilisés pour assurer la séparation des brins et le mouvement de la perle post-clivage. Dans un cas, des pièges optiques ont été utilisés pour mesurer le clivage de l’ADN par EcoRV14. Dans ces expériences, la recherche de cibles est l’objectif de l’enquête, avec des conditions optimisées de sorte que la liaison spécifique au site est l’étape limitant le taux. Un inconvénient des pièges optiques est qu’un seul ADN peut être observé à la fois. En outre, une force de traction importante périodique doit être appliquée pour tester la séparation du brin.
Une autre technique utilise une combinaison de flux et de forces magnétiques faibles pour tirer sur la perle d’une manière continue15. De cette façon, la diffusion du clivage limité par NdeI est mesurée. La méthode utilisée permet la mesure simultanée de plusieurs centaines d’ARN à la fois, permettant d’atteindre une signification statistique dans une seule expérience. Des expériences basées sur des pinces magnétiques ont également été utilisées. Dans une telle étude, une intégrase rétrovirale a été étudiée en incluant un DSB dans l’oligonucléotide d’insertion16. L’intégration réussie a eu comme conséquence l’incorporation de dsb dans l’ADN attaché et la perte de la perle attachée. Dans une étude similaire de l’EcoPI de restriction de type III dépendant de l’ATP, des dizaines d’ANN ont été observés dans une seule expérience17. Les pinces magnétiques détiennent l’avantage que la tension, ainsi que les boucles d’ADN, peuvent être contrôlées et surveillées pendant la réaction.
Présenté ici est une méthode très parallèle molécule unique pour mesurer la cinétique SSDC, qui tire parti des améliorations récentes dans l’attachement à grande échelle des DNA. Cette méthode est une amélioration et une extension des méthodes précédentes utilisées pour mesurer la réplication de l’ADN18, la longueur de contour de l’ADN19, et le clivage par REs15. Dans cette technique, les ADN linéaires contenant une seule copie de la séquence de reconnaissance sont préparés avec de la biotine à une extrémité et de la digoxigenine à l’autre. La biotine lie la streptavidine, qui est covalently attachée à une microbille paramagnétique. Les complexes de perles d’ADN sont injectés dans un canal microfluidique qui a été fonctionnalisé avec des fragments de FAB anti-digoxigenin. L’ADN s’attache ensuite aux points de fixation de surface par liaison de la digoxigenine aux fragments adsorbés fab. Les forces magnétiques faibles appliquées avec un aimant permanent empêchent la perle de coller non spécifiquement à la surface. Les échantillons peuvent être injectés rapidement (<30 s) dans le canal d’écoulement pour activer la réaction de clivage. Le flux est désactivé pendant la collecte de données. Comme chaque ADN est fendu, l’heure exacte du clivage peut être déterminée en enregistrant le cadre dans lequel la perle se déplace de haut en haut du plan focal de l’objectif, disparaissant ainsi de l’enregistrement vidéo. Un nombre image par image des perles restantes peut être utilisé pour quantifier la progression de la réaction.
Présenté ci-dessous est le protocole complet ainsi que des exemples de données recueillies à l’aide de NdeI. À titre d’exemple de la façon dont la technique peut être appliquée, les taux de clivage pour une gamme de concentrations de protéines sont mesurés à deux concentrations différentes de magnésium, un cofacteur métallique essentiel. Bien que cette application du protocole utilise NdeI, la méthode peut être adaptée pour une utilisation avec n’importe quelle nucléase spécifique au site en variant la conception du substrat d’ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole peut être utilisé pour mesurer la cinétique de n’importe quel système SSDC, à condition que la séparation des brins soit observée au cours de l’expérience. La détection du clivage est affectée par l’observation du détachement de la perle attachée et marque donc l’instant de la séparation des brins. Toutes les étapes précédentes se produisent avant la détection du clivage; ainsi, seul le temps total de transit est enregistré.
La cellule d’écoulement cov…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Subvention de la Fondation nationale des sciences MCB-1715317.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
References
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