Быстрая и экономически эффективная РНК-экстракция крысиной ткани поджелудочной железы
Summary
Чистота и целостность изолированной РНК является жизненно важным шагом в РНК зависимых анализов. Здесь мы представляем практический, быстрый и недорогой метод извлечения РНК из небольшого количества неповрежденной ткани поджелудочной железы.
Abstract
Независимо от метода экстракции, оптимизированная рнк-экстракция тканей и клеточных линий осуществляется в четыре этапа: 1) гомогенизация, 2) эффективная денатурация белков из РНК, 3) инактивация рибонуклеазы и 4) удаление загрязнения из ДНК, белков и углеводов. Тем не менее, это очень трудоемкий для поддержания целостности РНК, когда Есть высокий уровень RNase в ткани. Спонтанный аутолиз делает его очень трудно извлечь РНК из ткани поджелудочной железы, не повреждая его. Таким образом, практический метод извлечения РНК необходим для поддержания целостности тканей поджелудочной железы в процессе извлечения. Экспериментальное и сравнительное исследование существующих протоколов было проведено путем получения 20-30 мг тканей поджелудочной железы крыс менее чем за 2 минуты и извлечения РНК. Результаты были оценены электрофорезом. Эксперименты проводились трижды для обобщения результатов. Погружение ткани поджелудочной железы в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию на 24 ч дало высокую целостность РНК, когда реагент извлечения РНК использовался в качестве реагента. Полученные результаты были сопоставимы с результатами, полученными из коммерческих комплектов с привязками спиновой колонки.
Introduction
Структурные генные данные могут быть транскрибированы в функциональный продукт через экспрессию генов. Анализ РНК используется для обнаружения различий в экспрессии генов в различных условиях. Существует ряд методов извлечения нуклеиновых кислот следующим образом: гуанидиний тиоцианат, экстракция через фенол-хлороформ, целлюлозно-основанная хроматография, экстракция матрицами кремнезема ианион-обмен 1,,2.
Правильное обнаружение экспрессии генов зависит от целостности РНК, изолированной от тканей; поэтому крайне важно оценить целостность РНК, изолированной от тканей, до того, как будут проведены дальнейшие испытания, поскольку дополнительные молекулярные тесты на некачественной РНК могут поставить под угрозу результаты диагностического применения. Таким образом, высокой целостности РНК необходима для молекулярно-биологических тестов с различными диагностическими приложениями: количественные RT-PCR, микро-arrays, рибонуклеазы защиты анализа, северной помарки анализа, РНК-картирования, и строительство библиотеки cDNA3,4.
РНК становится довольно нестабильной после того, как хранится в течение длительного времени. Длинные фрагменты мРНК более 10 кб особенно восприимчивы кдеградации 5,,6. Таким образом, исследователи должны учитывать различные факторы, влияющие на целостность очищенной РНК. Чистота РНК должна быть защищена от RNases, белков, геномной ДНК и ферментативного загрязнения ингибиторами. Кроме того, наилучшее и приемлемое соотношение поглощения РНК к УФ (260/280) должно быть в пределах 1,8-2,0 с минимальной фрагментацией над электрофорезом. Недавно разработанные лабораторные методы позволили ученым оценить целостность образца молекулярного анализа болеепрактически 7,,8.
Гораздо труднее извлечь неповрежденную РНК из ткани поджелудочной железы, чем другие типы тканей из-за большого количества рибонуклейсов (RNases). Однако существующие методы экстракции, а именно быстрый выброс ткани поджелудочной железы из брюшной полости и гомогенизация при низких температурах, препятствующие RNases, оказалисьнеэффективными 7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14.
Целью нынешнего сравнительного экспериментального исследования является изменение и сравнение существующих методов для определения наиболее эффективных методов. С этой целью были изменены и сопоставлены различные протоколы извлечения РНК. Он был специально направлен на определение наименее дорогостоящего метода, требующего минимального количества ткани поджелудочной железы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В молекулярной биологии очень важно получить высококачественную РНК. Наличие ферментов рибонуклеазы в клетках и тканях быстро ухудшает РНК и делает экстракции сложным. RNases являются стабильными ферментами, функционирующими без каких-либо со-факторов. Небольшое количество RNase достаточ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нынешнее исследование было финансово поддержано Ширазского университета медицинских наук (Грант No 93-01-01-7178-03-07-2014). Мы благодарим г-на Зоморояна и г-на Ростами на кафедре электронного обучения в области медицинских наук, виртуальной школе и Центре передового опыта в области электронного обучения, Ширазском университете медицинских наук за редактирование видео.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
