쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출
Summary
격리된 RNA의 순도와 무결성은 RNA 의존적 인 에세이에서 중요한 단계입니다. 여기서, 우리는 손상되지 않은 췌장 조직의 소량에서 RNA를 추출하는 실용적이고 빠르며 저렴한 방법을 제시합니다.
Abstract
추출 방법에 관계없이 조직 및 세포주의 최적화된 RNA 추출은 RNA로부터 의 단백질의 1) 균질화, 2) 효과적인 단백질 성축, 3) 리보넥리스 비활성화, 4) DNA, 단백질 및 탄수화물로부터의 오염 제거의 4단계로 수행된다. 그러나, 조직에 RNase의 높은 수준이 있을 때 RNA의 무결성을 유지하는 것은 매우 힘들다. 자발적인 자가 분해는 그것을 손상시키지 않고 췌장 조직에서 RNA를 추출하는 것을 아주 어렵게 만듭니다. 따라서, 추출 과정에서 췌장 조직의 무결성을 유지하기 위해서는 실용적인 RNA 추출 방법이 필요하다. 기존 프로토콜의 실험 및 비교 연구는 2분 이내에 쥐 췌장 조직의 20-30 mg을 획득하고 RNA를 추출함으로써 수행되었다. 결과는 전기 전도에 의해 평가되었습니다. 실험은 결과의 일반화를 위해 세 번 수행되었다. RNA 안정화 시약에서 췌장 조직을 24시간 동안 -80°C로 침우시키는 것은 RNA 추출 시약으로 사용되었을 때 고결성 RNA를 산출하였다. 얻은 결과는 스핀 컬럼 바인딩이 있는 상용 키트에서 얻은 결과와 비교할 수 있었습니다.
Introduction
구조적 유전자 데이터는 유전자 발현을 통해 기능성 제품에 전사될 수 있다. RNA 분석은 다른 조건에 걸쳐 유전자 발현의 다름을 발견하기 위하여 이용됩니다. 다음과 같이 핵산을 추출하는 방법에는 여러 가지가 있습니다: guanidinium thiocyanate, 페놀 클로로폼을 통한 추출, 셀룰로오스 계 크로마토그래피, 실리카 행렬에 의한 추출, 및 애니온 교환1,,2.
유전자 발현의 적절한 검출은 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성에 의해 좌우됩니다. 따라서, 저품질 RNA에 대한 보완적인 분자 검사가 진단 적용 결과를 위태롭게 할 수 있기 때문에 추가 검사가 수행되기 전에 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성을 평가하는 것이 중요합니다. 따라서, 정량적 RT-PCR, 마이크로 어레이, 리보너클로스 보호 분석, 북부 블롯 분석, RNA 매핑 및 cDNA 라이브러리 건설3,,4: 따라서, 고무결성 RNA는 다른 진단 응용 프로그램을 가진 분자 생물학적 시험에 필요하다.
RNA는 오랜 시간 동안 보관된 후에 오히려 불안정해집니다. 10kb 이상의 긴 mRNA 단편은 특히 분해5,,6에취약하다. 따라서, 연구원은 정제 된 RNA의 무결성에 영향을 미치는 다양 한 요인을 고려해 야 한다. RNA의 순도는 RNases, 단백질, 게놈 DNA 및 효소 억제제 오염에 대하여 보호되어야 합니다. 또한, RNA와 UV(260/280)의 가장 우수하고 허용 가능한 흡수비는 전기전도에 비해 최소 단편화로 1.8-2.0 범위 내에 있어야 한다. 최근 개발된 실험실 기술을 통해 과학자들은 분자 분석 샘플의 무결성을 보다 실질적으로7,,8로평가할 수 있게 되었다.
많은 양의 ribonucleases (RNases)로 인해 다른 유형의 조직보다 췌장 조직에서 손상되지 않은 RNA를 추출하는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 그러나, 기존의 추출 방법, 즉 RNases를 방해하기 위해 저온에서 복강 및 균질화로부터 췌장 조직의 신속한 배출은 효과가 없는 것으로 입증되었으며,7,,8,9,9,10,,11,,12,,13,,14.
본 비교 실험 연구의 목적은 기존 방법을 수정하고 비교하여 가장 효율적인 방법을 결정하는 것이다. 이를 위해, RNA 추출의 다양한 프로토콜이 수정되고 비교되었다. 그것은 특히 췌장 조직의 최소 금액을 필요로 하는 가장 저렴한 방법을 결정 하기 위한.
Protocol
Representative Results
Discussion
분자 생물학에서는 고품질 RNA를 얻는 것이 중요합니다. 세포와 조직에 있는 ribonuclease 효소의 존재는 RNA를 빨리 저하시키고 추출 복합체를 만듭니다. RNases는 어떤 공동 요인 없이 작동 하는 안정적인 효소. 소량의 RNase는 RNA를 파괴하기에 충분합니다. 쥐 췌장 조직이 복강에서 제거되면 강한 세제에 의해 수술 기구를 소독하고 철저히 헹구고 수술 전에 RNases를 비활성화하기 위해 240 °C에서 적어도 4…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 시라즈 의과 대학에 의해 재정적으로 지원되었다 (그랜트 번호 93-01-01-7178\03-07-2014). 조모로디안 씨와 로스타미(Rostami) 의학 과학 분야의 e-러닝 학과, 가상 학교 및 e-러닝 우수 센터, 시라즈 의료 과학 대학이 비디오를 편집해 주셔서 감사합니다.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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