Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad
Summary
Renhet och integritet av den isolerade RNA är ett viktigt steg i RNA beroende analyser. Här presenterar vi en praktisk, snabb och billig metod för att extrahera RNA från en liten mängd oskadad bukspottskörtelvävnad.
Abstract
Oavsett utvinningsmetoden, optimerad RNA utvinning av vävnader och cellinjer utförs i fyra steg: 1) homogenisering, 2) effektiv denaturering av proteiner från RNA, 3) ribonukleas inaktivering, och 4) avlägsnande av kontaminering från DNA, proteiner, och kolhydrater. Det är dock mycket mödosamt att upprätthålla integriteten hos RNA när det finns höga nivåer av RNase i vävnaden. Spontan autolys gör det mycket svårt att extrahera RNA från bukspottskörteln vävnad utan att skada den. Således behövs en praktisk RNA-extraktionsmetod för att upprätthålla integriteten hos bukspottskörtelvävnader under extraktionsprocessen. En experimentell och jämförande studie av befintliga protokoll genomfördes genom att erhålla 20-30 mg av råtta bukspottskörteln vävnader på mindre än 2 minuter och extrahera RNA. Resultaten bedömdes med elektrofores. Experimenten utfördes tre gånger för generalisering av resultaten. Nedsänkning bukspottskörteln vävnad i RNA stabilisering reagens vid -80 °C för 24 h gav hög integritet RNA, när RNA extraktion reagens användes som reagens. De erhållna resultaten var jämförbara med de resultat som erhållits från kommersiella kit med spinnkolumnbindningar.
Introduction
Strukturella gendata kan transkriberas till en funktionell produkt genom genuttryck. RNA-analys används för att upptäcka skillnader i genuttryck över olika förhållanden. Det finns ett antal metoder för att extrahera nukleinsyror enligt följande: guanidiniumtiocyanat, extraktion via fenol-kloroform, cellulosabaserad kromatografi, extraktion genom kiseldioxidmatriser, och anjon-utbyte1,2.
Korrekt detektion av genuttryck påverkas av integriteten hos RNA som isolerats från vävnader; därför är det livsviktigt att utvärdera integriteten hos RNA som isolerats från vävnader innan ytterligare tester genomförs eftersom kompletterande molekylära tester på RNA av låg kvalitet kan äventyra diagnostiska applikationsresultat. Således är hög integritet RNA behövs för molekylärbiologiska tester med olika diagnostiska tillämpningar: kvantitativa RT-PCR, mikro-arrayer, ribonukleas skydd assay, norra blot analys, RNA-mappning, och cDNA bibliotekkonstruktion 3,4.
RNA blir ganska instabilt efter att ha hållits länge. Långa mRNA-fragment över 10 kb är särskilt känsliga för nedbrytning5,6. Således måste forskare överväga olika faktorer som påverkar integriteten hos renat RNA. Renheten hos RNA måste skyddas mot RNaser, proteiner, genomiskt DNA, och enzymatisk hämmar kontaminering. Dessutom måste det bästa och acceptabla absorptionsförhållandet för RNA till UV (260/280) ligga inom intervallet 1,8-2,0 med minsta fragmentering över elektrofores. Nyligen utvecklade laboratorietekniker har gjort det möjligt för forskare att utvärdera integriteten hos molekylär analysprov mer praktiskt7,8.
Det är mycket svårare att extrahera oskadade RNA från bukspottskörteln vävnad än andra typer av vävnader på grund av den höga mängden av ribonukleases (RNases). Dock har befintliga extraktionsmetoder, nämligen den snabba utskjutningen av bukspottskörteln vävnad från bukhålan och homogenisering vid låga temperaturer för att hindra RNases, visat sigvara ineffektiva 7,8,9,10,11,12,13,14.
Syftet med den föreliggande jämförande experimentella studien är att modifiera och jämföra befintliga metoder för att bestämma de mest effektiva metoderna. För detta ändamål ändrades och jämfördes olika protokoll för RNA-utvinning. Det var särskilt syftar till att fastställa den billigaste metoden kräver en minsta mängd bukspottskörteln vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inom molekylärbiologi är det livsviktigt att få RNA av hög kvalitet. Förekomsten av ribonukleasenzymerna i celler och vävnader försämrar snabbt RNA och gör extraktionen komplex. RNaser är stabila enzymer fungerar utan några co-faktorer. Små mängder av RNase är tillräckliga för att förstöra RNA. När råttpanspottskörtelns vävnad avlägsnas från bukhålan är det nödvändigt att desinficera de kirurgiska instrumenten genom starka rengöringsmedel, skölj dem noggrant och lägg dem i en ugn i minst 4 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den föreliggande studien stöddes ekonomiskt av Shiraz University of Medical Sciences (anslag nr 93-01-01-7178\03-07-2014). Vi tackar Mr Zomorodian och Mr Rostami vid institutionen för e-lärande i medicinska vetenskaper, Virtual School och Center of Excellence i e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences för redigering av video.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
