마이크로코일을 이용한 초고장 자기 공명 현미경검사법(MRM)을 이용하여 고공간 분해능에서 생물학적 조직을 연구하는 프로토콜이 제시된다. 마이크로코일을 특성화하기 위한 단계별 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 이미징의 최적화는 식물 뿌리에서 입증됩니다.
이 프로토콜은 MR 현미경(MRM)이라고도 하는 고해상도 자기 공명 영상(MRI)을 위해 설계된 생물학적 샘플과 결합된 솔레노이달 마이크로코일을 위한 신호 대 잡음 비(SNR) 교정 및 샘플 준비 방법을 설명합니다. 그것은 메디카고 트런카툴라 뿌리 샘플에서 입증 된 전 임상 MRI 분광기에서 사용될 수있다. 마이크로코일은 RF 공진기의 크기를 관심 샘플 크기와 일치시켜 감도를 높여 주어진 데이터 수집 시간에 더 높은 이미지 해상도를 가능하게 합니다. 비교적 간단한 설계로 인해 솔레노이드 마이크로코일은 간단하고 저렴하며 시료 요구 사항에 쉽게 적응할 수 있습니다. 체계적으로, 우리는 참조 솔루션을 사용하여, 새로운 또는 가정 내장 마이크로 코일을 보정하는 방법을 설명합니다. 교정 단계는 다음과 같습니다: 견과류 곡선을 이용한 펄스 전력 결정; RF 필드 균질성의 추정; 표준 펄스 시퀀스를 사용하여 볼륨 정규화된 신호 대 잡음 비율(SNR)을 계산합니다. 작은 생물학적 시료에 대한 샘플 준비에 중요한 단계뿐만 아니라 자기 감수성 차이와 같은 가능한 완화 인자를 논의합니다. 최적화된 솔레노이드 코일의 응용 은 루트 샘플의 고해상도(13 x 13 x 13 μm3, 2.2 pL) 3D 이미징으로 입증됩니다.
자기 공명 화상 진찰은 인간에서 단세포1,2,3에구역 수색하는 다양한 생물학적 표본을 비침습적으로 이미지화하는 다목적 도구이다. 의료 영상 응용 프로그램에 대한 MRI 스캐너는 일반적으로 1.5 T ~ 3 T의 필드 강도를 가진 자석을 사용하지만, 단일 셀 응용 프로그램은 훨씬 더 높은 필드 강도1,3,4에서이미지된다. 백 마이크로미터 이하의 해상도에서 표본을 연구한 연구는 자기 공명 현미경 검사법(MRM)5라고합니다. 그러나 MRM은 다른 사용 가능한 현미경 검사법 또는 이미징 기술(예: 광학 현미경 검사법 또는 CT)에 비해 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 앓고 있습니다. SNR6을최적화하기 위해 몇 가지 방법을 추구할 수 있습니다. 한 가지 방법은 더 높은 자기장 강도를 사용하는 반면, 상호 보완적인 접근 방식은 개별 샘플에 대한 신호 검출기를 최적화하는 것입니다. 후자의 경우 감지기의 치수를 관심 샘플의 치수에 맞게 조정해야 합니다. 직경이 ≈0.5-2mm인 작은 샘플(예: 루트 조직)의 경우, 마이크로코일은 SNR이 코일 직경6,7에반비례하기 때문에 유용합니다. 전용 마이크로코일8을사용하여 동물 세포에서 7.8 x 7.8 x 15 μm3의 해상도를 달성하였다. 다양한 마이크로코일 유형이 존재하며, 평면 및 솔레노이드 코일은 응용 및 조직 형상9에따라 가장 일반적으로 사용된다. 평면 코일은 표면에 가까운 높은 감도를 가지므로 얇은 조각의 응용 제품에 유용합니다. 예를 들어, 이미징 을 위해 특별히 설계된 방법은 평면 마이크로코일(10)에대해 설명되었다. 그러나 평면 코일은 감도가 높고 잘 정의된 기준 펄스 전력이 없습니다. 원통형인 솔레노이드 코일은 더 넓은 적용 영역을 가지며 두꺼운 시료에 더 선호됩니다. 여기서, 우리는 솔레노이드 코일의 특성, 마이크로코일 MRI에 대한 샘플을 준비하는 프로토콜뿐만 아니라 솔레노이드 마이크로코일(도1A)의보정을 설명한다.
솔레노이드 코일은 코르크 스크류와 같은 전도 와이어 코일로 구성되어 있으며, 샘플을 들고 있는 모세관주위(도 1B). 마이크로코일 어셈블리는 에나멜 구리 와이어, 커패시터 구색 및 부품을 납땜에 적합한베이스(도 1B)만사용하여 구성할 수 있다. 가장 큰 장점은 단위 볼륨 당 SNR 및 B1 필드 균질성 측면에서 좋은 성능 특성과 결합 된 단순성과 저렴한 비용입니다. 시공의 용이성은 코일 설계 및 형상을 빠르게 반복할 수 있게 해줍니다. 솔레노이드 마이크로코일 설계 및 프로브 특성화(즉, 다양한 코일 기하학에 대한 전자이론, 워크벤치 측정 및 분광계 측정)의 특정 요구 사항은7, 11,12,13,14에서광범위하게 설명되었다.
솔레노이드 코일은 다른 곳에서 설명된 지침에 따라 원하는 치수에 대한 설계 규칙을 염두에 두어 제작할 수 있다15,16. 이 특정 한 경우, 코일은 1.5 mm의 내경으로 사용되었으며, 에나멜 구리 와이어로 만들어졌으며 직경 0.4mm, 외경 1.5mm의 모세관 주위에 반복되었습니다. 이 솔레노이드는 튜닝 커패시터(2.5 pF), 가변 매칭 커패시터(1.5-6 pF) 및 구리 연결와이어(도 1A, 1C)로구성된 회로가 만들어지는 베이스 플레이트에서 유지된다. 튜닝 커패시터는 950MHz의 원하는 공진 주파수를 달성하기 위해 선택되며, 일치하는 커패시터는 50 옴의 임피던스에서 최대 신호 전송을 달성하기 위해 선택된다. 커패시터가 클수록 더 미세한 조정이 가능합니다. 정기적인 동작에서는 프로브 베이스의 커패시터를 사용하여 튜닝 및 매칭이 수행됩니다. 조립된 마이크로코일은 자석에 삽입할 수 있도록 프로브에 장착해야 합니다. 시스템에 따라 추가 홀더가 필요할 수 있습니다. 여기에서는 22.3 T 자석 조합과 브루커 콘솔 Avance III HD를 Micro5 프로브와 결합하여 사용합니다. 이 경우, 프로브의 1H채널(도 1A)에연결하는 데 필요한 연결을 갖춘 수정된 지지 인서트를 사용했습니다.
코일의 감수성 매칭 설계에는 침윤성 불일치를 줄이기 위해 침윤액이 있는 저수지가 포함되어 있으며, 구리 코일에서 발생하는 것은샘플(17)에근접한 것으로 발생한다. 저수지는 코일을 감싸고 포블린으로 채워진 플라스틱 주사기로 만들어졌습니다. 불피성 액체가 코일을 둘러싸야 하므로 시료의 사용 가능한 직경은 외지름을 1mm로 감소시킵니다. 시료 의 변화를 용이하게 하기 위해, 시료는 외지 1mm, 내경 700 μm의 모세관에서 제조하였다. 샘플 준비에 필요한 도구는 그림 2A에표시됩니다.
기본 실험 MR 매개 변수는 그라데이션 시스템, 필드 강도 및 콘솔을 포함하여 사용되는 시스템의 하드웨어에 크게 의존합니다. 여러 매개 변수는 시스템 성능을 설명하는 데 사용할 수 있으며, 그 중 90° 펄스 길이와 전력, 단위 부피당 B1-균질성 및 SNR(SNR/mm3)이가장 실질적으로 관련이 있습니다. SNR/mm3은 동일한시스템(18)에서다른 코일의 성능을 비교하는 데 유용합니다. 시스템 간 하드웨어 차이가 존재할 수 있지만 벤치마킹 프로토콜을 균일하게 적용하면 시스템 성능 비교도 용이하게 됩니다.
이 프로토콜은 교정 및 샘플 준비에 중점을 둡니다. 솔레노이드 마이크로코일의 성능의 단계별 특성이 표시됩니다: 90° 펄스 길이 또는 전력을 보정; RF-필드 균질성 평가; 단위 볼륨당 SNR 계산(SNR/mm3). 팬텀을 이용한 표준화된 스핀 에코 측정은 코일 설계의 비교를 용이하게 하기 위해 설명되어 있어 고유한 응용 분야의 최적화를 가능하게 합니다. 마이크로코일에 특이적인 팬텀 및 생물학적 표본 샘플 제제가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 시판되는 마이크로이미징 시스템을 갖춘 적합한 좁은 보어(≤60mm) 수직 자석에 구현될 수 있다. 다른 시스템의 경우 지침역할을 할 수 있으며 일부 조정과 함께 사용할 수 있습니다.
MRI 측정을 위한 생물학적 표본 준비는 일반적으로 표본이 가능한 한 온전한 것으로 심계되기 때문에 매우 광범위하지 않습니다. 그러나, 생물학적 조직의 공기 공간은 자기감수성(19)의차이로 인해 이미지 아티팩트를 유발할 수 있다. 자기장강도(20)가증가함에 따라 효과가 증가한다. 따라서, 공기 공간은 높은 필드 강도에서 피해야 하며, 조직 주위의 공기를 피하고 조직 구조 내의 공기 공간을 제거하기 위해 액체에 샘플의 침수를 요구할 수 있다. 특히, 마이크로코일이 사용될 때, 원하는 견본 조직의 절제가 필요할 지도 모릅니다, 적당한 액체에 그것을 잠수하는 선행. 이것은 미리 절단된 모세관에 견본의 삽입에 선행되고, 마지막으로 모세관 왁스로 모세관을 밀봉합니다. 접착제, 화염 밀봉 또는 대안 대신 실란트로 왁스를 사용하면 샘플을 쉽게 추출할 수 있습니다. 이 절차는 메디카고 트런카툴라, 작은 콩류 식물의 뿌리에 입증된다. 이 프로토콜의 장점은 MRI 측정 중에 샘플이 파괴되지 않기 때문에 광학 현미경 검사법을 사용하여 MRI 데이터를 후속 공동 등록할 가능성이 있습니다.
제시된 프로토콜은 시투 측정에서 높은 공간 해상도에 적합하며, 보다 정교한 설계를 통해 생명 유지 시스템과 관련된 문제를 해결해야 하는 생체 내 샘플을 이미징할 수 있습니다.
이 프로토콜은 많은 재료와 지질 학적 샘플이 여기에서 사용되는 서열에 의해 이미지 될 수없는 T2 이완 시간을 상당히 짧기 때문에 생물학적 샘플에 가장 적합합니다. 높은 시료 자기 감수성을 나타내는 일부 생물학적 조직조차도, 그 효과가 필드강도(24)와상관관계가 있기 때문에 초고장에서 이미지화하기 어려울 수 있다. 이 프로토콜은 새로운 코일에 유용할 뿐만 아니라 잠재적인 문제의 문제 해결 및 진단에도 도움이 될 수 있습니다. 새 또는 알 수 없는 샘플을 테스트할 때 이 프로토콜은 참조 솔루션에서 사전에 수행하여 실험 설정이 사양에 따라 작동하는지 확인할 수 있습니다. 이는 분광기가 아티팩트 및 오작동의 원인으로 제외될 수 있기 때문에 문제 해결에 도움이 됩니다. 또한 프로브의 튜닝 및 일치 커패시터를 마이크로코일의 일반적인 값으로 설정합니다.
첫 번째 실험시 신호가 기록되지 않으면, 시료가 보이는지 확인하기 위해 국소화 스캔의 시야를 확대할 수 있다. 다음으로 코일이 올바르게 조정되었는지 다시 확인하고 다른 로컬라이저 스캔을 시도합니다. 코일이 의도하지 않은 추가 공진 모드를 나타낼 수 있으며, 이 경우 올바른 공진 모드를 결정해야 합니다. 여전히 이미지를 얻을 수 없는 경우 샘플을 제거하여 마이크로코일 어셈블리 내의 위치를 확인하고 샘플이 손상되지 않았는지 확인합니다(즉, 씰의 기포 나 누출이 없음). 마지막으로, 샘플은 PFD 대신 물로 제조될 수 있다. 시료가 국소화 스캔에서 감지 가능한 신호를 거의 제공하지 않으면 모세관의 주변 물을 여전히 감지할 수 있습니다.
마이크로코일은 시료에 이상적으로 매우 가깝기 때문에, 공기와 와이어 사이의 자기 감수성 차이는 도 7B에서볼 수 있듯이 추가 신호 손실을 일으킬 수 있다. 잠재적인 아티팩트에는 공간 매핑 및 비정상적인 신호 강도 변화가 포함됩니다. 특히 그라데이션 에코 형 펄스 서열은 이러한 균일하지 않은 신호 손실의 영향을 받습니다. 이러한 이유로, 우리는 불소 액체 (Fomblin 또는 FC-43)에 와이어를 침수하여 감수성 일치 코일을 제시했다. 이 프로토콜에 포함된 B1 추정 방법은 B1 감수성 차이가 코일 어셈블리 설계에 감수성 매칭 전략의 포함을 보증하는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 감수성과 일치하는 코일을 구성하는 또 다른 방법은 감수성 일치와이어(25)를사용하는 것입니다. 또한 코일로 인한 감수성 문제만 이 접근 법으로 해결됩니다. 샘플 내부의 감수성 불일치(예: 에어 스페이스로 인한)는 여전히 어려운 일입니다.
에어 포켓 또는 기포는 공기 와 유체 또는시편(19)의 인터페이스에서 감수성 차이로 인한 광범위한 신호 손실을 유발하는 실험적 과제를 제기합니다(그림5A). 성공적인 샘플 준비의 중요한 측면은 시료와 모세관 모두의 침수입니다. 그러나 작은 거품조차도 특히 그라데이션 에코 유형 시퀀스의 경우 신호 손실을 일으킬 수 있습니다. 이동식 기포는 샘플과 접촉할 때까지 모세관을 통해 이동할 수 있습니다. 이러한 효과 중 일부는 한쪽 끝이 다른 쪽 끝이 더 높을 수 있도록 모세관을 약간 기울임으로써 완화 될 수 있습니다. 기울기는 시료를 방해하지 않고 더 높은 쪽끝에 잠재적기거품이 제자리에 유지되도록 합니다. 탈수가 큰 기포가 형성될 수 있기 때문에 모세관 왁스가 좋은 밀봉을 형성한다는 것도 중요합니다.
샘플 내부의 공기 공간에 대해, PFD는세포막(26)을관통하지 않고 세포간 공기 공간을 채우는 데 사용되었다. 그러나, 이 접근 방식에도 불구하고, 우리는 모든 공기 공간을 제거 할 수 없었다. 또한,이 방법은 우리가 가능한 한 비 침습적으로 시스템을 연구하고자하는 욕망으로 인해 일반적으로 바람직하지 않은 추가 에이전트가 필요하다는 것을 의미합니다.
모세 혈관의 원통형 모양은 특히 생검이나 살아있는 뿌리 물질의 프로세스연구와 같은 부패에 취약한 조직을 위해 관류 설정이 실행 가능해야 한다는 것을 의미합니다. 두 단계는 관류 설정을 실현할 수 있습니다. 첫째, 미디엄 피드 튜브와 모세관의 양쪽에 배수관을 연결하는 것은 체모스타트(chemostat)를 만들기에 충분할 것이다. 둘째, 시료 모세관에 들여쓰기를 첨가하면 흐름 방향에 대한 샘플을 제자리에 고정시킬 수 있었다. 이것은 평면 마이크로코일(10)에대해 발표 된 프로토콜과 유사합니다.
MR 이미징의 비침습적 특성은 이 프로토콜(PFD 또는 Fomblin)에 사용된 불활성 액체와 결합되어 실험 완료 후, 추가 연구를 위해 모세혈관에서 샘플을 제거할 수 있습니다. 조합은 광학 또는 전자 현미경 검사법과 그밖 파괴적인 화상 진찰 기술을 포함합니다. 우리는 최근에 Medicago 트런카툴라 루트 결절27에광학 현미경 검사법과 조합을 시연했습니다.
우리는 초고장 NMR 분광계에 전용 마이크로코일을 사용하여 식물 물질을 이미징하는 방법을 시연했습니다. 상대적으로 큰 샘플 볼륨은 좋은 RF 균질성을 가진 고해상도에서 연구될 수 있습니다. 더욱이, 분광 화상 진찰은 그렇지 않으면 가능하지 않은 보다는 더 높은 해상도에서 수행될 수 있습니다. 마이크로코일 설계를 샘플에 적용하면 코일 성능 특성을 결정하는 효율적인 방법에 의해 촉진됩니다. 솔레노이드 코일 접근법은 또한 동물 조직을 포함한 식물보다 다른 샘플에 쉽게 적용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
950MHz 기기의 실험은 네덜란드의 NWO 지원 국가 로드맵 대규모 시설(프로젝트 184.032.207)인 uNMR-NL에 의해 지원되었습니다. R.S.는 바이오솔라셀 컨소시엄 프로젝트 U2.3의 지원을 받았습니다. J.R.K.는 네덜란드 의 자기 공명 연구 학교 (NMARRS) 대학원 [022.005.029]에 의해 지원되었다. 우리는 메디카고 트런카툴라 샘플을 제공 한 Defeng Shen과 톤 비셀링에게 감사드립니다. 또한, klaartje Houben, 마리 르노, 요한 반 데르 Zwan이 uNMR-NL 시설에서 기술 지원을 해 준 것에 대해 감사드립니다. 또한 볼커 레만, 헤니 얀센, 피터 드 와드에게 기술적인 도움을 주신 것에 대해서도 감사드립니다. 프랭크 버지블트, 존 필립피, 카르후드 비 사이 산카르 굽타에게 그들의 조언을 전해 주셔서 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 비디오에 음성 해설을 제공 제시카 드 루이터 감사합니다.
Reference solution preparation | |||
CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
Sample preparation | |||
Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
Syringe | Generic | – | Used to apply PFD and manipulate the sample |
Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
Imaging Hardware | |||
22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
Air cooler | Bruker GmbH | – | Used to regulate probe temperature |
Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
RF microcoil | Home-built | – | contains Fomblin |
Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |