En protokoll for å studere biologisk vev ved høy romlig oppløsning ved hjelp av ultrahøy feltmagnetisk resonansmikroskopi (MRM) ved hjelp av mikrokyler presenteres. Trinnvise instruksjoner er gitt for å karakterisere mikrospolene. Til slutt demonstreres optimalisering av bildebehandling på planterøtter.
Denne protokollen beskriver et signal-til-støy-forhold (SNR) kalibrering og prøveforberedelsesmetode for magnetal mikrokyler kombinert med biologiske prøver, designet for høyoppløselig magnetisk resonansavbildning (MR), også referert til som MR-mikroskopi (MRM). Den kan brukes ved prekliniske MR-spektrometre, demonstrert på Medicago avkortularotprøver . Mikrokyler øker følsomheten ved å matche størrelsen på RF-resonatoren til størrelsen på utvalget av interesse, og dermed muliggjør høyere bildeoppløsninger i en gitt datainnsamlingstid. På grunn av den relativt enkle designen er magnetiske mikrokyler enkle og billige å konstruere og kan enkelt tilpasses prøvekravene. Systematisk forklarer vi hvordan vi kalibrerer nye eller hjemmebygde mikrokyler ved hjelp av en referanseløsning. Kalibreringstrinnene inkluderer: pulskraftbestemmelse ved hjelp av en nøttekurve; estimering av RF-felt homogenitet; og beregne et volum-normalisert signal-til-støy-forhold (SNR) ved hjelp av standard pulssekvenser. Viktige trinn i prøveforberedelsen for små biologiske prøver diskuteres, samt mulige begrensende faktorer som magnetiske følsomhetsforskjeller. Anvendelsene av en optimalisert solenoid spole er demonstrert ved høy oppløsning (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D-avbildning av en rotprøve.
Magnetisk resonansavbildning er et allsidig verktøy for å ikkeinvasivt bilde et bredt utvalg av biologiske prøver, alt fra mennesker tilenkeltceller 1,2,3. Mens MR-skannere for medisinske bildebehandlingsprogrammer vanligvis bruker magneter med en feltstyrke på 1,5 T til 3 T, blir enkeltcelleapplikasjoner avbildet ved mye høyere feltstyrker1,3,4. Studien av prøver ved oppløsninger under hundre mikrometer kalles magnetisk resonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider imidlertid av et lavt signal-til-støy-forhold (SNR) sammenlignet med andre tilgjengelige mikroskopi- eller bildeteknikker (f.eks. optisk mikroskopi eller CT). Flere tilnærminger kan forfølges for å optimalisere SNR6. En tilnærming er å bruke en høyere magnetfeltstyrke, mens en komplementær tilnærming er å optimalisere signaldetektoren for individuelle prøver. For sistnevnte bør dimensjonene på detektoren justeres for å matche dimensjonene til utvalget av interesse. For små prøver som er ≈0,5-2 mm i diameter (f.eks. rotvev), mikrospoler er nyttige som SNR er omvendt proporsjonal med spolediameteren6,7. Oppløsninger så høyt som 7,8 x 7,8 x 15 μm3 har blitt oppnådd på dyreceller ved hjelp av dedikertemikrokyler 8. En rekke mikrospoletyper finnes, med planar og magnetspoler som oftest brukes, avhengig av påføring og vevgeometri9. Planar spoler har høy følsomhet nær overflaten, noe som er nyttig for applikasjoner på tynne skiver. For eksempel har en metode designet spesielt for avbildning av perfused vev blitt beskrevet for planar mikrospoler10. Planarspoler har imidlertid en høy falloff av følsomhet og ingen veldefinert referansepulskraft. Solenoid spoler, som er sylindriske, har et bredere bruksområde og er mer favorisert for tykkere prøver. Her beskriver vi egenskapene til solenoidspolen, en protokoll for å forberede prøver for mikrospole MR, samt kalibreringen av en solenoid mikrospole (figur 1A).
Den magnetspolen består av en ledende ledning kveilet, som en korketrekker, rundt en kapillær som holder prøven (figur 1B). Mikrospoleenheter kan konstrueres ved hjelp av bare emaljert kobbertråd, et utvalg av kondensatorer og en egnet base for lodde av komponentene (figur 1B). De viktigste fordelene er enkelheten og lave kostnader, kombinert med gode ytelsesegenskaper når det gjelder SNR per enhetsvolum og B1-felthomogenitet. Den enkle konstruksjonen muliggjør rask iterasjon av spoledesign og geometrier. De spesifikke kravene til solenoid mikrospole design og sonde karakterisering (det vil, teorien om elektronikk, arbeidsbenk målinger, og spektrometer målinger for en rekke spole geometrier) har blitt beskrevet mye andresteder 7,11,12,13,14.
En solenoid spole kan bygges ved å huske designregler for de ønskede dimensjonene i henhold til retningslinjene beskrevet andresteder 15,16. I dette spesifikke tilfellet ble en spole brukt med en indre diameter på 1,5 mm, laget av emaljert kobbertråd, 0, 4 mm i diameter, loopet rundt en kapillær på 1,5 mm ytre diameter. Denne magneten holdes på en bunnplate der en krets er laget, bestående av en tuning kondensator (2,5 pF), en variabel matchende kondensator (1,5-6 pF) samt kobber tilkoblingsledninger (figur 1A, 1C). Tuning kondensatoren er valgt for å oppnå ønsket resonansfrekvens på 950 MHz, mens den matchende kondensatoren er valgt for å oppnå maksimal signaloverføring med en impedans på 50 Ohm. Den større kondensatoren er variabel for å tillate finere justering. I vanlig drift utføres justering og matching ved hjelp av kondensatorer i probebasen. Den monterte mikrospolen må monteres på en sonde slik at den kan settes inn i magneten. En ekstra holder kan være nødvendig, avhengig av systemet. Her bruker vi en 22,3 T magnetkombinasjon med en Bruker Console Avance III HD i kombinasjon med en Micro5-sonde. I dette tilfellet brukte vi en modifisert støtteinnsats utstyrt med de nødvendige tilkoblingene for å koble til 1H-kanalen til sonden (figur 1A).
Den mottakelighetstilpassede utformingen av spolen inkluderer et reservoar med perfluorinert væske for å redusere følsomhetskonflikter, som oppstår som følge av at kobberspolen er i nærheten avprøven 17. Et reservoar ble laget av en plastsprøyte for å omslutte spolen og fylt med fomblin. Etter hvert som den perfluorerte væsken må omslutte spolen, reduseres den tilgjengelige diameteren for en prøve til en ytre diameter på 1 mm. For enkel prøveendring ble prøven tilberedt i en kapillær med en ytre diameter på 1 mm og en indre diameter på 700 μm. De nødvendige verktøyene for prøveklargjøring er vist i figur 2A.
Grunnleggende eksperimentelle MR-parametere er svært avhengig av maskinvaren i systemet som brukes, inkludert gradientsystem, feltstyrke og konsoll. Flere parametere kan brukes til å beskrive systemytelsen, hvorav 90° pulslengde og effekt, B1-homogenitet og SNR per enhetsvolum (SNR/ mm3),er de mest praktisk relevante. SNR/mm3 er nyttig for å sammenligne ytelsen til forskjellige spoler på samme system18. Selv om maskinvareforskjeller på tvers av systemer kan eksistere, forenkler den ensartede anvendelsen av en benchmarking-protokoll også sammenligningen av systemytelsen.
Denne protokollen fokuserer på kalibrering og prøveklargjøring. Den trinnvise karakteriseringen av ytelsen til solenoide mikrokyler er vist: kalibrere 90° pulslengde eller effekt; vurdere RF-feltet homogenitet; og beregning av SNR per enhetsvolum (SNR/mm3). En standardisert spin-ekko måling ved hjelp av et fantom er beskrevet for å lette en sammenligning av spole design, noe som gjør det mulig for optimalisering av forskjellige applikasjoner. Phantom og biologiske prøveprøvepreparater, spesifikke for mikrospoler, er beskrevet. Protokollen kan implementeres på en egnet smal boring (≤60 mm) vertikal magnet utstyrt med et kommersielt tilgjengelig mikroimagingssystem. For andre systemer kan den fungere som en retningslinje og kan brukes med noen justeringer.
Biologisk prøveforberedelse for MR-målinger er vanligvis ikke veldig omfattende siden prøven er avbildet så intakt som mulig. Luftrom i biologisk vev kan imidlertid forårsake bildeartefakter på grunn av forskjeller i magnetiskmottakelighet 19. Effekten øker med økende magnetfeltstyrke20. Dermed bør luftrommene unngås ved høye feltstyrker, og dette kan kreve nedsenking av prøven i en væske for å unngå luft rundt vevet og fjerning av luftrom i vevsstrukturene. Spesielt når mikrospoler er ansatt, kan det være nødvendig med utskjæring av ønsket prøvevev, etterfulgt av å senke det ned i en passende væske. Dette etterfølges av innsetting av prøven i en forhåndskuttet kapillær, og til slutt forsegle kapillær med kapillærvoks. Bruk av voks som tetningsmasse i stedet for lim, flammeforsegling eller alternativer, betyr at prøven lett kan ekstraheres. Denne prosedyren er demonstrert på roten av Medicago truncatula, en liten belgfrukter plante. En fordel med denne protokollen er potensialet for påfølgende samtidig registrering av MR-data med optisk mikroskopi, siden prøven ikke ødelegges under MR-målingen.
Den presenterte protokollen er egnet for høy romlig oppløsning i situ målinger, og mer forseggjorte design kan tillate bildebehandling in vivo prøver, der utfordringer knyttet til livet støttesystemer må løses.
Denne protokollen er best egnet til biologiske prøver, da mange materialer og geologiske prøver har betydelig kortere T2 avslapningstider, som ikke kan avbildes av sekvensene som brukes her. Selv noen biologiske vev, som viser høy prøve magnetisk følsomhet heterogenitet, kan være vanskelig å bilde på ultra-høyt felt som effektene er korrelert til feltet styrke24. Protokollen er ikke bare nyttig for nye spoler, men kan også hjelpe til med feilsøking og diagnose av potensielle problemer. Når du tester nye eller ukjente prøver, kan denne protokollen utføres på forhånd på referanseløsningen for å kontrollere at det eksperimentelle oppsettet fungerer i henhold til spesifikasjonene. Dette hjelpemidler i feilsøking siden spektrometeret kan utelukkes som en kilde til artefakter og funksjonsfeil. I tillegg setter dette tuning og matchende kondensatorer på sonden til verdier som er typiske for mikrospolen.
Når ingen signal registreres ved det første eksperimentet, kan synsfeltet for lokaliseringsskanningen forstørres for å sjekke om prøven vises. Deretter må du kontrollere om spolen er riktig innstilt og forsøke en annen lokaliseringsskanning. Det er mulig at spolen viser flere utilsiktede resonansmodimoduser, i så fall må den riktige bestemmes. Hvis det fortsatt ikke er noe bilde, fjerner du prøven for å kontrollere posisjonen i mikrospolenheten og kontrollerer at prøven er intakt (det vil si at det ikke er noen luftbobler eller lekkasjer i tetningene). Til slutt kan en prøve tilberedes med vann i stedet for PFD. Hvis prøven gir lite påvisbart signal i lokaliseringsskanningen, kan det omkringliggende vannet i kapillæren fortsatt oppdages.
Siden mikrospoler er ideelt svært nær prøven, kan de magnetiske følsomhetsforskjellene mellom luften og ledningen forårsake ekstra signaltap, som vist i figur 7B. Potensielle artefakter inkluderer romlig mismapping og uregelmessig signalintensitetsvariasjon. Spesielt gradient-ekko type pulssekvenser påvirkes av dette ikke-ensartede signaltapet. Av denne grunn presenterte vi en følsomhetsmatchet spole, ved å senke ledningen i fluorvæske (Fomblin eller FC-43). B1 estimeringsmetoden som inngår i denne protokollen, kan bidra til å avgjøre om B1-følsomhetsforskjellene garanterer inkludering av følsomhetsmatchingsstrategier i utformingen av spoleenheten. En alternativ tilnærming for å konstruere en mottakelighet matchet spole er å bruke mottakelighet-matchetwire 25. Videre er bare mottakelighetsproblemer på grunn av spolen adressert med denne tilnærmingen. Følsomhetskonflikter inne i prøven (f.eks. på grunn av luftrom) er fortsatt utfordrende.
Luftlommer eller bobler utgjør en eksperimentell utfordring som forårsaker omfattende signaltap, forårsaket av følsomhetsforskjeller i luftgrensesnittet og væsken ellerprøven 19 (figur 5A). Et kritisk aspekt ved vellykket prøveklargjøring er nedsenking av både prøve og kapillær. Imidlertid kan selv små bobler forårsake signaltap, spesielt for gradient ekko type sekvenser. Mobile luftbobler kan migrere gjennom kapillæren til de er i kontakt med prøven. Noen av disse effektene kan lindres ved litt vippe kapillær slik at den ene enden er høyere enn den andre. Tilting sikrer at potensielle luftbobler holdes på plass i den høyere enden, uten å forstyrre prøven. Det er også viktig å kontrollere at kapillærvoks danner en god forsegling, da dehydrering kan føre til at store luftbobler dannes.
For luftrommene inne i prøven ble PFD brukt til å fylle opp de intercellulære luftrommene mens de ikke penetrerte cellemembranene26. Men selv med denne tilnærmingen var vi ikke i stand til å fjerne alle luftrom. I tillegg betyr denne tilnærmingen at vi trenger en ekstra agent, som vanligvis ikke er foretrukket på grunn av ønsket om å studere et system så ikke-invasivt som mulig.
Den sylindriske formen på kapillærer betyr at perfusjonsoppsett skal være levedyktige, spesielt for vev som er sårbare for forfall, for eksempel biopsier eller studieprosesser i levende rotmateriale. To trinn kunne realisere et perfusjonsoppsett. Først ville det være tilstrekkelig å koble til et medium materør samt et avløpsrør på hver side av kapillæren til å lage en kjemostat. For det andre kan tillegg av en innrykk i prøvekapillæren holde prøven på plass mot strømningsretningen. Dette er analogt med en protokoll publisert for planar mikrospoler10.
Den ikke-invasive karakteren av MR-avbildning, kombinert med den inerte væsken som brukes i denne protokollen (PFD eller Fomblin) betyr etter ferdigstillelse av eksperimenter, prøver kan fjernes fra sine kapillærer for videre studier. Kombinasjoner inkluderer optisk eller elektronmikroskopi og andre destruktive bildeteknikker. Vi har nylig vist en kombinasjon med optisk mikroskopi på Medicago avkortula rotknipper27.
Vi har demonstrert en metode for bildeanleggsmateriale ved hjelp av dedikerte mikrospoler på et ultrahøyt felt-NMR-spektrometer. Relativt store utvalgsvolumer kan studeres ved høy oppløsning med god RF homogenitet. Videre kan spektroskopisk bildebehandling utføres ved høyere oppløsninger enn ellers mulig. Tilpasning av mikrospoledesign til prøver forenkles ved en effektiv metode for å bestemme spoleytelsesegenskaper. Den solenoid spole tilnærming kan også lett brukes på andre prøver enn planter, inkludert dyrevev.
The authors have nothing to disclose.
Eksperimenter ved 950 MHz-instrumentet ble støttet av uNMR-NL, et NWO-finansiert nasjonalt veikart stort anlegg i Nederland (prosjekt 184.032.207). R.S. ble støttet av BioSolarCells konsortiumprosjektet U2.3. J.R.K. ble støttet av Nederlands Magnetic Resonance Research School (NMARRS) graduate school [022.005.029]. Vi takker Defeng Shen og Ton Bisseling for å ha levert Medicago-avkortulaprøvene. Vi takker videre Klaartje Houben, Marie Renault og Johan van der Zwan for teknisk støtte ved uNMR-NL-anlegget. Vi vil også takke Volker Lehmann, Henny Janssen og Pieter de Waard for teknisk hjelp. Vi uttrykker vår takknemlighet til Frank Vergeldt, John Philippi og Karthick B. Sai Sankar Gupta for deres råd. Til slutt takker vi Jessica de Ruiter for å ha gitt stemmen til videoen.
Reference solution preparation | |||
CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
Sample preparation | |||
Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
Syringe | Generic | – | Used to apply PFD and manipulate the sample |
Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
Imaging Hardware | |||
22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
Air cooler | Bruker GmbH | – | Used to regulate probe temperature |
Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
RF microcoil | Home-built | – | contains Fomblin |
Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |