Ett protokoll för att studera biologisk vävnad med hög rumslig upplösning med ultra-hög fält magnetisk resonansmikroskopi (MRM) med hjälp av mikrokyler presenteras. Steg-för-steg-instruktioner tillhandahålls för att karakterisera mikroskopilerna. Slutligen demonstreras optimering av avbildning på växtrötter.
Detta protokoll beskriver en kalibrering för signal-till-brus -förhållande (SNR) och provberedningsmetod för solenoidala mikroskopiering kombinerat med biologiska prover, konstruerade för högupplöst magnetresonanstomografi (MRT), även kallad MR-mikroskopi (MRM). Det får användas vid prekliniska MR-spektrometrar, påvisas på Medicago truncatula rotprover . Mikroskopor ökar känsligheten genom att matcha storleken på RF-resonatorn med storleken på urvalet av intresse och möjliggör därmed högre bildupplösningar under en viss datainhämtningstid. På grund av den relativt enkla designen är solenoidal mikrokyler okomplicerade och billiga att konstruera och kan enkelt anpassas till provkraven. Systematiskt förklarar vi hur man kalibrerar nya eller hembyggda mikrokyler, med hjälp av en referenslösning. Kalibreringsstegen omfattar: pulseffektbestämning med hjälp av en nutationskurva; uppskattning av RF-fältets homogenitet. och beräkna ett volymnormaliserat signal-brusförhållande (SNR) med hjälp av standardpulssekvenser. Viktiga steg i provberedning för små biologiska prover diskuteras, samt möjliga förmildrande faktorer såsom magnetiska känslighetsskillnader. Tillämpningarna av en optimerad solenoidspole demonstreras genom högupplöst (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D-avbildning av ett rotprov.
Magnetisk resonanstomografi är ett mångsidigt verktyg för att noninvasively bild en mängd olika biologiska exemplar, allt från människortill enstakaceller 1,2,3. Medan MRI-skannrar för medicinska bildframställningsprogram vanligtvis använder magneter med en fältstyrka på 1,5 T till 3 T, avbildas encellsapplikationer vid mycket högre fältstyrka1,3,4. Studien av exemplar vid upplösningar under hundra mikrometer benämns magnetresonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider dock av ett lågt signal-brusförhållande (SNR) jämfört med andra tillgängliga mikroskopi- eller avbildningstekniker (t.ex. optisk mikroskopi eller CT). Flera tillvägagångssätt kan eftersträvas för att optimera SNR6. Ett tillvägagångssätt är att använda en högre magnetfältstyrka, medan ett kompletterande tillvägagångssätt är att optimera signaldetektorn för enskilda prover. För den senare bör dimensionerna av detektorn justeras för att matcha måtten på provet av intresse. För små prover som är ≈0,5-2 mm i diameter (t.ex. rotvävnader) är mikroskopier användbart eftersom SNR är omvänt proportionell mot spoldiametern6,7. Upplösningar så höga som 7,8 x 7,8 x 15 μm3 har uppnåtts på djurceller med hjälp av dedikerade mikroskylder8. En mängd olika mikrospoletyper finns, med planar och solenoid spolar som oftast används beroende på ansökan och vävnad geometri9. Planar spolar har hög känslighet nära sin yta, vilket är användbart för applikationer på tunna skivor. Till exempel har en metod som utformats speciellt för avbildning perfused vävnad beskrivits för planar mikroskylor10. Dock har planar spolar en hög falloff av känslighet och ingen väldefinierad referenspulseffekt. Solenoid spolar, är cylindriska, har ett större område av ansökan och är mer gynnade för tjockare prover. Här beskriver vi egenskaperna hos solenoidspolen, ett protokoll för att förbereda prover för mikrospole MRI, samt kalibreringen av en solenoid mikrokyl (Figur 1A).
Solenoidspolen består av en ledande tråd som är ihopspolad, som en korkskruv, runt en kapillär som håller provet (Figur 1B). Mikrokolaggregat kan konstrueras med endast emaljerad koppartråd, ett sortiment av kondensatorer, och en lämplig bas för lödning av komponenterna (Figur 1B). De stora fördelarna är enkelheten och den låga kostnaden, kombinerat med goda prestandaegenskaper vad gäller SNR per enhetsvolym och B1-fälthomogenitet. Den enkla konstruktionen möjliggör snabb iteration av spole mönster och geometrier. De särskilda kraven på solenoid mikrokyldesign och sondkarakterisering (dvs., teorin om elektronik, mätningar arbetsbänk, och spektrometer mätningar för en mängd olika spole geometrier) har beskrivits utförligt på andraställen 7,11,12,13,14.
En solenoidspole kan byggas genom att man i åtanke har konstruktionsregler för de önskade dimensionerna enligt de riktlinjer som beskrivs påandra ställen 15,16. I detta specifika fall användes en spole med en innerdiameter på 1,5 mm, tillverkad av emaljerad koppartråd, 0,4 mm i diameter, loopade runt en kapillär på 1,5 mm yttre diameter. Denna solenoid hålls på en basplatta på vilken en krets görs, som består av en trimkondensator (2,5 pF), en variabel matchande kondensator (1,5-6 pF) samt koppar anslutningsledningar (Figur 1A, 1C). Trimkondensatorn väljs för att uppnå önskad resonansfrekvens på 950 MHz, medan den matchande kondensatorn väljs för att uppnå den maximala signalöverföringen vid en impedans på 50 Ohm. Den större kondensatorn är variabel för att möjliggöra finare justering. Vid regelbunden drift utförs trimning och matchning med hjälp av kondensatorer i probbasen. Den monterade mikrospolen behöver monteras på en sond så att den kan sättas in i magneten. Ytterligare en hållare kan krävas, beroende på systemet. Här använder vi en 22,3 T-magnetkombination med en Bruker Console Avance III HD i kombination med en Micro5-sond. I detta fall använde vi en modifierad stödinsats utrustad med nödvändiga anslutningar för att ansluta till sondens 1H-kanal (Bild 1A).
Spolens känslighetsmatchade utformning omfattar en reservoar med perfluorerad vätska för att minska känslighetsfel, som uppstår genom att kopparspolen ligger i närheten av provet17. En reservoar gjordes från en plastspruta för att innesluta spolen och fylld med fomblin. Eftersom den perfluorerade vätskan behöver omsluta spolen, reduceras den tillgängliga diametern för ett prov till en ytterdiameter på 1 mm. För att underlätta provbytet, preparerades provet i en kapillär med en ytterdiameter på 1 mm och en innerdiameter på 700 μm. Nödvändiga verktyg för provberedning visas i figur 2A.
Grundläggande experimentella MR-parametrar är mycket beroende av maskinvaran i det system som används, inklusive gradientsystem, fältstyrka och konsol. Flera parametrar kan användas för att beskriva systemets prestanda, av vilka 90° pulslängd och effekt, B1-homogenitet och SNR per enhetsvolym (SNR/mm3), är de mest praktiskt relevanta. SNR/mm3 är användbart för att jämföra prestanda för olika spolar på samma system18. Medan hårdvara skillnader mellan system kan finnas, en enhetlig tillämpning av ett benchmarking protokoll underlättar också jämförelsen av systemets prestanda.
Detta protokoll fokuserar på kalibrering och provberedning. Den stegvisa karakterisering av prestanda solenoid mikrokylor visas: kalibrera 90 ° pulslängd eller effekt; bedöma RF- fältet homogenitet; och beräkna SNR per volymenhet (SNR/mm3). En standardiserad spin-echo mätning med hjälp av en fantom beskrivs för att underlätta en jämförelse av spole mönster, som möjliggör optimering av distinkta applikationer. Fantom och biologiska provprovspreparat, specifika för mikrokolor, beskrivs. Protokollet får implementeras på vilken lämplig smalborst (≤60 mm) vertikal magnet som är utrustad med ett kommersiellt tillgängligt mikrobildsystem. För andra system kan den fungera som en riktlinje och kan användas med vissa justeringar.
Biologisk preparering av preparat för MR-mätningar är vanligtvis inte särskilt omfattande eftersom exemplaret avbildas så intakt som möjligt. Luftutrymmen i biologisk vävnad kan dock orsaka bildartefakter på grund av skillnader i magnetisk känslighet19. Effekten ökar med ökande magnetfältstyrka20. Således bör luftutrymmen undvikas vid höga fältst gioner, och detta kan kräva nedsänkning av provet i en vätska för att undvika luft runt vävnaden och avlägsnande av luftutrymmen inom vävnadsstrukturerna. Specifikt, när mikroskopiler är anställda, excision av önskad provvävnad kan krävas, följt av att dränka den i en lämplig vätska. Detta följs av insättning av provet i en förskuren kapillär, och slutligen tätning av kapillären med kapillärvax. Att använda vax som tätningsmedel istället för lim, flamtätning eller alternativ, innebär att provet lätt kan extraheras. Detta förfarande påvisas på roten av Medicago truncatula, en liten baljväxt. En fördel med detta protokoll är potentialen för efterföljande samregistrering av MR-data med optisk mikroskopi, eftersom provet inte förstörs under MR-mätningen.
Det presenterade protokollet är lämpligt för hög rumslig upplösning in situ mätningar, och mer genomarbetade mönster skulle kunna möjliggöra avbildning in vivo prover, där utmaningar relaterade till livsuppehållande system skulle behöva åtgärdas.
Detta protokoll är bäst lämpad för biologiska prover, eftersom många material och geologiska prover har betydligt kortare T2 avkopplingstider, som inte kan avbildas av de sekvenser som används här. Även vissa biologiska vävnader, som uppvisar högprov magnetiska känslighet heterogenitet, kan vara svårt att bilden på ultra-högt fält som effekterna är korrelerade till fältet styrka24. Protokollet är inte bara användbart för nya spolar men kan också stöd vid felsökning och diagnos av potentiella problem. När du testar nya eller okända prover kan detta protokoll utföras i förväg på referenslösningen för att verifiera att experimentinställningen fungerar enligt specifikationer. Detta hjälpmedel i felsökning eftersom spektrometern kan uteslutas som en källa till artefakter och funktionsstörningar. Dessutom ställer detta in trim- och matchningskondensatorerna på sonden till värden som är typiska för mikrospolen.
När ingen signal registreras vid det första experimentet kan synfältet för lokalisatorskanningen förstoras för att kontrollera om provet ses. Därefter återkollera om spolen är korrekt inställd och försök till en annan localizer scan. Det är möjligheten, att spolen ställer ut extra unintended resonant lägen, i vilket fall den korrekta måste att vara beslutsam. Om det fortfarande inte går att få någon bild, avlägsna provet för att kontrollera dess läge inom mikrospoleenheten och kontrollera att provet är intakt (dvs. inga luftbubblor eller läckor i tätningarna förekommer). Slutligen kan ett prov beredas med vatten i stället för PFD. I fall provet ger lite detekterbar signal i localizer scan, kan det omgivande vattnet i kapillären fortfarande upptäckas.
Eftersom mikroskopiler är idealiskt mycket nära provet kan de magnetiska känslighetsskillnaderna mellan luften och tråden orsaka ytterligare signalförlust, vilket kan ses i figur 7B. Potentiella artefakter inkluderar spatial mismapping och avvikande signalintensitetsvariation. Speciellt övertoning-echo typ pulssekvenser påverkas av denna icke-enhetliga signalförlust. Av denna anledning presenterade vi en mottaglighet-matchade spole, genom att nedsänka tråden i fluorinert vätska (Fomblin eller FC-43). B 1 uppskattningsmetod som ingår i detta protokoll kan hjälpa till att avgöra om B1 känslighetsskillnader motiverar införandet av känslighet matchning strategier i utformningen av spolen montering. Ett alternativt tillvägagångssätt för att konstruera en mottaglighet matchade spole är att använda känslighet-matchade tråd25. Vidare behandlas endast mottaglighetsfrågor på grund av spolen med detta tillvägagångssätt. Känslighetsfel i provet (t.ex. på grund av luftutrymmen) är fortfarande utmanande.
Luftfickor eller bubblor utgör en experimentell utmaning som orsakar omfattande signalförlust, orsakad av känslighetsskillnader vid luftens gränssnitt och vätskan ellerexemplaret 19 (Figur 5A). En kritisk aspekt av framgångsrik provpreparation är nedsänkningen av både prov och kapillär. Även små bubblor kan dock orsaka signalförluster, särskilt för tonings echo typ sekvenser. Mobila luftbubblor kan migrera genom kapillären tills de har kontakt med provet. Några av dessa effekter kan lindras genom att något luta kapillären så att ena änden är högre än den andra. Tiltning säkerställer att potentiella luftbubblor hålls på plats i den högre änden, utan att störa provet. Det är också viktigt att kontrollera att kapillärvaxet bildar en bra tätning, eftersom uttorkning kan orsaka att stora luftbubblor bildas.
För luftutrymmena inuti provet användes PFD för att fylla upp de intercellulära luftutrymmena samtidigt som de inte trängde in i cellmembranen26. Men även med detta tillvägagångssätt kunde vi inte ta bort alla luftutrymmen. Dessutom innebär detta tillvägagångssätt att vi behöver ytterligare ett medel, vilket vanligtvis inte är att föredra på grund av önskan att studera ett system så noninvasively som möjligt.
Den cylindriska formen av kapillärer innebär att perfusionsuppställningar ska vara livskraftiga, särskilt för vävnader som är sårbara för förfall, såsom biopsier eller studerar processer i levande rotmaterial. Två steg kunde realisera en perfusionsinställning. För det första skulle det vara tillräckligt att ansluta ett medelhögt matningsrör samt ett avloppsrör på vardera sidan av kapillären för att skapa en chemostat. För det andra kunde tillsatsen av ett indrag i provkampillären hålla provet på plats mot flödesriktningen. Detta är analogt med ett protokoll som publicerats för planar mikrokyler10.
Noninvasiv karaktär av MR imaging, kombinerat med inert vätskan som används i detta protokoll (PFD eller Fomblin) medel efter avslutad experiment, prover kan tas bort från sina kapillärer för vidare studier. Kombinationer inkluderar optisk eller elektronmikroskopi och andra destruktiva avbildningstekniker. Vi har nyligen visat en kombination med optisk mikroskopi på Medicago truncatula rot knölar27.
Vi har visat en metod för bildtagning växtmaterial med hjälp av dedikerade mikroskylor på en ultra-hög fält NMR spektrometer. Relativt stora provvolymer kan studeras vid hög upplösning med god RF-homogenitet. Vidare kan spektroskopisk avbildning utföras med högre upplösningar än annars genomförbara. Anpassning av mikrospolens utformning till prover underlättas genom en effektiv metod för att fastställa egenskaper för spolprestanda. Metoden med solenoidspole kan också lätt tillämpas på andra prover än växter, inklusive djurvävnad.
The authors have nothing to disclose.
Experiment vid instrumentet 950 MHz stöddes av uNMR-NL, en NWO-finansierad National Roadmap Large-Scale Facility of the Netherlands (projekt 184.032.207). R.S. stöddes av BioSolarCells konsortiumprojekt U2.3. J.R.K. stöddes av Nederländernas kärnresonansforskningsskola (NMARRS) forskarskola [022.005.029]. Vi tackar Defeng Shen och Ton Bisseling för att de tillhandahåller Medicago-truncatulaproverna. Vi tackar vidare Klaartje Houben, Marie Renault, och Johan van der Zwan för teknisk support på uNMR-NL anläggningen. Vi vill också tacka Volker Lehmann, Henny Janssen och Pieter de Waard för teknisk hjälp. Vi uttrycker vår tacksamhet till Frank Vergeldt, John Philippi och Karthick B. Sai Sankar Gupta för deras råd. Slutligen tackar vi Jessica de Ruiter för att ge voice-over till videon.
Reference solution preparation | |||
CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
Sample preparation | |||
Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
Syringe | Generic | – | Used to apply PFD and manipulate the sample |
Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
Imaging Hardware | |||
22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
Air cooler | Bruker GmbH | – | Used to regulate probe temperature |
Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
RF microcoil | Home-built | – | contains Fomblin |
Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |