Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale
Summary
L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.
Abstract
Les métastases, principale cause de morbidité et de mortalité chez la plupart des patients atteints de cancer, peuvent être difficiles à modéliser précliniquement chez la souris. Peu de modèles de métastases spontanées sont disponibles. Ainsi, le modèle expérimental de métastases impliquant l’injection de lignées cellulaires appropriées dans la veine caudale est un pilier de la recherche sur les métastases. Lorsque des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine latérale de la queue, le poumon est leur site préféré de colonisation. Une limitation potentielle de cette technique est la quantification précise de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Alors que certains chercheurs comptent les macrométastases d’une taille prédéfinie et/ou incluent des micrométastases après la coupe des tissus, d’autres déterminent la zone des lésions métastatiques par rapport à la zone tissulaire normale. Ces deux méthodes de quantification peuvent être extrêmement difficiles lorsque la charge métastatique est élevée. Ici, nous démontrons un modèle d’injection intraveineuse de métastases pulmonaires suivi d’une méthode avancée pour quantifier la charge tumorale métastatique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ce processus permet d’étudier plusieurs paramètres du point final, y compris la taille moyenne des métastases, le nombre total de métastases et la zone totale des métastases, afin de fournir une analyse complète. De plus, cette méthode a été examinée par un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists (SEK) pour en assurer l’exactitude.
Introduction
Bien qu’il s’agisse d’un processus très complexe et inefficace1, les métastases contribuent de manière significative à la morbidité et à la mortalité des patients atteints de cancer2. En fait, la plupart des décès liés au cancer sont attribués à la propagation métastatique de la maladie3,4. Pour que les cellules tumorales réussissent à métastaser, elles doivent se détacher du site primaire, envahir par le stroma adjacent, s’intravaser dans la circulation sanguine ou lymphatique, se rendre au lit capillaire d’un site secondaire, extravaser dans le tissu secondaire et proliférer ou se développer pour former des lésions métastatiques5. L’utilisation de modèles murins a été essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’ensemencement et de la croissance métastatiques6,7. Ici, nous nous concentrons sur les métastases du cancer du sein, pour lesquelles des modèles murins génétiquement modifiés ainsi que des méthodes de transplantation sont souvent utilisés – chacun avec son propre ensemble d’avantages et de limites.
Les modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés utilisent des promoteurs spécifiques de la glande mammaire, y compris MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) et WAP (Whey Acidic Protein), pour stimuler l’expression des transgènes dans l’épithélium mammaire8. Les oncogènes, y compris l’antigène T moyen polyoma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 et le virus simien 40 (SV40) ont été exprimés de cette manière9,10,11,12,13, et bien que ces modèles génétiques soient utiles pour étudier l’initiation et la progression de la tumeur primaire, peu se métastasent facilement vers des organes distants. De plus, ces modèles génétiques murins sont souvent plus longs et plus coûteux que les modèles de métastases spontanées ou expérimentales. Compte tenu de la limitation de la plupart des modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés pour étudier les métastases, les techniques de transplantation sont devenues des méthodes attrayantes pour étudier ce processus complexe. Cela comprend l’injection orthotopique, veineuse de la queue, intracardiaque et intracrânienne de lignées cellulaires appropriées.
Bien que plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein métastasent facilement après une injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire14,15, la consistance et la reproductibilité de la charge tumorale métastatique peuvent être un défi, et la durée de telles études peut être de l’ordre de plusieurs mois. Pour évaluer les métastases pulmonaires, en particulier, l’injection intraveineuse dans la veine de la queue est souvent une méthode plus reproductible et plus rapide, la propagation métastatique se produisant généralement en l’espace de quelques semaines. Cependant, étant donné que le modèle d’injection intraveineuse contourne les étapes initiales de la cascade métastatique, il faut faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats de ces études. Dans cette démonstration, nous montrons l’injection de cellules tumorales mammaires dans la veine caudale ainsi qu’une méthode d’analyse précise et complète.
Même si le milieu de la recherche a fait des progrès importants dans la compréhension du processus complexe des métastases du cancer du sein, on estime que plus de 150 000 femmes sont actuellement atteintes d’un cancer du sein métastatique16. Parmi les personnes atteintes d’un cancer du sein de stade IV, >36 % des patientes ont des métastases pulmonaires17; toutefois, le profil et l’incidence des métastases propres au site peuvent varier en fonction du sous-type moléculaire18,19,20,21. Les patientes atteintes de métastases pulmonaires associées au cancer du sein ont une survie médiane de seulement 21 mois, ce qui souligne la nécessité d’identifier des traitements efficaces et de nouveaux biomarqueurs pour cette maladie17. L’utilisation de modèles expérimentaux de métastases, y compris l’injection intraveineuse de cellules tumorales, continuera de faire progresser nos connaissances sur cet important défi clinique. Lorsqu’elles sont combinées à la pathologie par imagerie numérique et à la méthode d’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique décrite dans ce protocole, les injections de veines de la queue sont un outil précieux pour la recherche sur les métastases du cancer du sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que les chercheurs continuent d’utiliser l’injection intraveineuse de cellules tumorales comme modèle expérimental pour les métastases, les pratiques standard pour analyser la charge tumorale métastatique qui en résulte font défaut. Dans certains cas, des différences significatives dans la charge tumorale métastatique lors de la manipulation de lignées cellulaires particulières et / ou de l’utilisation de composés chimiques peuvent être observées macroscopiquement. Cependant, dans d’autres cas,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les données représentatives ont été financées par l’Institut national du cancer (K22CA218549 à S.T.S). En plus de leur aide dans le développement de la méthode d’analyse complète décrite ici, nous remercions l’Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directrice – Krista La Perle, DVM, PhD) pour les services d’histologie et d’immunohistochimie et le Pathology Imaging Core pour le développement et l’analyse d’algorithmes.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
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