תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן
Summary
הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.
Abstract
התרומה של המיטוכונדריה לטרנספורמציה אונקוגנית היא נושא של עניין רחב ומחקר פעיל. ככל שתחום חילוף החומרים של הסרטן הופך מורכב יותר, המטרה של מיקוד המיטוכונדריה באמצעות תרכובות שונות שגורמות לנזק מיטוכונדריאלי (מה שנקרא מיטוקנים) הופך פופולרי למדי. למרבה הצער, רבים קיימים cytotoxicity assays, כגון אלה המבוססים על מלחי tetrazolium או resazurin דורשים אנזימים מיטוכונדריאליים פונקציונליים עבור הביצועים שלהם. הנזק שנגרם על ידי תרכובות כי היעד המיטוכונדריה לעתים קרובות פוגע הדיוק של אלה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה המבוסס על כתם דיפרנציאלי עם שני צבעי פלורסנט, אחד מהם הוא תא חודר (Hoechst 33342) והשני הוא לא (פרודיד פרופידיום). ההבדל בכתמים מאפשר להפלות תאים חיים ומתים. ההסכם ניתן למיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה, אשר מגביר את התפוקה ומפחית הטיה. זה גם מאפשר את ההסחמה לשמש באופן בתפוקה גבוהה באמצעות צלחות 96-באר, מה שהופך אותו אופציה בת קיימא עבור מאמצי גילוי סמים, במיוחד כאשר התרופות המדוברות יש רמה מסוימת של מיטוקסיות. חשוב לציין, תוצאות שהושגו על ידי Hoechst / PI כתמים assay להראות עקביות מוגברת, הן עם תוצאות הדרה כחול trypan ובין שכפולים ביולוגיים כאשר ההשוואה מושווה שיטות אחרות.
Introduction
הצעד הראשון לזיהוי טיפולים יעילים בסרטן הוא הבחירה של סיסוקסיות cytotoxicity חזקה, משוחדת שניתן להשתמש בה כדי לבחון את ההשפעה של הטיפול. בחירה נפוצה לניסויים בתפוקה נמוכה היא הדרה של צבע כחול trypan מתאי חיים. שיטה זו מועדפת כי היא מאפשרת שיטה יחסית משוחדת לכמת את הישרדות התא. טריפאן כחול מפזר באופן פסיבי לתוך תאים שהמברנות שלהם בסכנה, אבל זה חסום ביעילות מלהיכנס לתאים בריאים1. המנה של התאים החיים ואת התאים הכולל מייצג את הכדאיות אחוז, אשר מצביע על היעילות של הטיפול. החיסרון המשמעותי ביותר של ה-trypan Blue assay הוא שהוא אינו מתאים באופן גרוע לתודולוגיות בתפוקה גבוהה. יש לו יחס אות לרעש נמוך יחסית וכתמים ממושכים יכולים לגרום לחפצים בשל הכתמה של תאים קיימא. כתוצאה מכך, הדרה כחול trypan הוא בדרך כלל, אבל לא תמיד2, ירד לספירה ידנית. זה עושה את זה איטי מדי ומציג את האפשרות החזקה של הטיה בשל שיפוט סובייקטיבי של החוקר (אלא אם כן ספירות מסנוור או עצמאי משמשים, אשר להפחית עוד יותר את תפוקת המעבדה). באופן כללי, התפוקה של תפוקה זו אינה מספיקה לגילוי סמים מודרני.
הכדאיות, שבדרך כלל יש לה תפוקה הרבה יותר גבוהה, מאפשרת לחוקרים לעקוף מגבלה זו, אך מגיעים עם אזהרות משמעותיות (ראה טבלה 1). שיטות אלה בדרך כלל נופלות לשתי קבוצות. קבוצה אחת מורכבת מאסרים צבעוניים המבוססים על הפונקציה של אנזימי רדוקס תאיים. מצעים חסרי צבע או שאינם פלורסנט מומרים למוצרים מלאי חיים שניתן לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר. דוגמאות קלאסיות כוללות מלחי טרטאזוליום (MTT, WST-1, XTT וכו’) ורסזורין. קטגוריה זו כוללת גם תסדירות זוהרות המשתמשות בלוציפרין כדי להעריך את רמת ה-ATP. לנתונים מסוג זה יש את המגבלה הבסיסית שהם מודדים את חילוף החומרים התאי, שהוא לא יכולת הכדאיות הסלולרית כשעצמה. זה די נפוץ עבור תאים להיות התרכך בתנאים שליליים, אבל עדיין לשמור על היכולת לחלק3,4,5. לדוגמה, תאי גזע סרטניים הם לעתים קרובות יחסית מטבוליתהרהיות 6,7,8,9, והם צפויים להיות קשה לומר באמצעות טכניקות אלה. יעילות של טיפולים המים נזק לתפקוד המיטוכונדריאלי, כגון רוב המיטוקנים, גם צפוי להיות מוערך יתר על המידה באופן משמעותי.
מתודולוגיה חלופית ממנפת את המאפיינים הכימיים של חומרים שונים המאפשרים להם לחצות או לא לחצות קרום ביולוגי. דוגמה אחת היא כתמים גרעיניים כגון SYTOX או פרודיד פרופידיום (PI). קטגוריה זו כוללת גם מאמרים הדומים בקונספט אך שונים בתפקודם, כגון ההירוגנאז של הקטט (LDH), המודד את שחרורו של LDH לתוך המילייה החוץ-תאי כאינדיקטור של נמק תאי (איור 1, טבלה 1). ההתאסות האלה מסוגלות יותר להבחין בין תאים לא פעילים מבחינה מטבולית לבין תאים מתים.
| תסה/צבע | זוהו סוגים של מוות בתאים | ציוד נחוץ | תכונות עיקריות |
| MTT, CKK-8, אלמר בלו (רזורין) | אפופטוזיס/נמק | ספקטרופוטומטר | זול, מהיר; תסה נקודת קצה; תלוי בפעילות של אנזימים (מיטוכונדריאלי באופן בלעדי במקרה של MTT) ואינו מפלה בין מצבי מוות של תאים1,10 |
| שחרור LDH | נמק | ספקטרופוטומטר | מהיר, ללא תלות בפעילות אנזימים מיטוכונדריאליים; יקר לבדיקות בתפוקה גבוהה; מזהה תאים נמקים עם קרום פלזמה מופשר11,12 |
| כחול טריפאן (ש”ב) | אפופטוזיס/נמק | מיקרוסקופ | תא מושלם; אינו מפלה בין מצבי מוות של תאים; עבודה ולא מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה; קשה יותר לשימוש עם תאים נדבקים; נוטה לשיפוט סובייקטיבי של המשתמש, אך נחשב לשיטת מדידת הכדאיות הסטנדרטית של התא13 |
| תפוז ים עצין (AO) | אפופטוזיס/נמק/ | מיקרוסקופ פלואורסצי | צבע חומצה גרעין עם תכונות ספקטרליות ייחודיות, יכול להבחין בין אפופטוזיס ונמק/נמק14 |
| נקרופטוזיס (נמק) | |||
| הוצ’סט 33342, DAPI | אפופטוזיס | מיקרוסקופ פלואורסציטי או ציטומטר זרימה | חדיר לתא; לא הולם בכוחות עצמו כדי לפקח על מוות תאים; שימושי להכתמה ב- co; יכול לשמש כדי להעריך עיסוק כרומטין ופיצול גרעין אפופטוזיס מוקדם; ניתן לזווג עם פרודיד פרופידיום להבחין אפופטוזיס מן הנמק15,16 |
| פרופידיום לודיד(פי אי) | אפופטוזיס/נמק מאוחר | מיקרוסקופ פלואורסציטי או ציטומטר זרימה | מנטרל תאי מושלם; מזהה הן אפופטוזיס מאוחר והן מצב נמק של מוות תא17. רעיל וחמלי לאחר דגירה ארוכה פעמים18 |
שולחן 1 . רשימת ההתארות של ציטו-אקסיות. Cytotoxicity assays, שחלקם שימשו במחקר זה, המפורטים יחד עם התיאור הקצר של התכונות העיקריות שלהם.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חילוף החומרים המיטוכונדריאלי משתנה בכמהסוגי סרטן 19,20,21,22,23,24,25. לדוגמה, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוצגו כדי להגן על המסה המיטוכונדריאלית שלהם, תוכן mtDNA, ונשימה מיטוכונדריאלית כדי לענות עלדרישות האנרגיה שלהם 19,26,27. מצד שני, כמה גידולים מוצקים מאופיינים בתפקוד מיטוכונדריאלי, או ליתר דיוק “תכנות מחדש חילוף חומרים”, כגון downregulation של חלבונים מיטוכונדריאלי מעורב OXPHOS או ירידה בתכנים mtDNA, כי היה קשור פולשניות גידול, פוטנציאל גרורתי והתנגדות לתרופות מעוררות אפופטוזיס28,29. יתר על כן, לאחרונה, יש כבר עניין מוגבר באמצעות תרכובות מגוונות מכנית המשפיעים על תפקוד המיטוכונדריאלי (נקרא בדרך כללמיטוקאן 30),כטיפוליו פוטנציאליים עבור סוגי סרטן מסוימים. תרופות אלה מתמקדות סינתזה ATP, DNA מיטוכונדריאלי, OXPHOS, ו- ROS ייצור, כמו גם פרו אפופטוטי ואנטי אפופטוטי חלבונים הקשורים המיטוכונדריה30,31. מספר מחקרים הראו כי גישה זו יש הבטחהמשמעותית 19,32,33,34. עם זאת, סטיות מטבוליות אלה בביולוגיה של תאים סרטניים או טיפולים פילוח מיטוכונדריה עשוי להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות המקובלת המבוססת על פונקציונליות מיטוכונדריאלית.
כאן, פרוטוקול ממוטב לתגרה גרעינית דיפרנציאלית מתואר. הפרוטוקול מאפשר קביעה מהירה ומדויקת של רעילות ציטוקוקסיות של מיטוקנים או השילובים שלהם עם תרכובות אחרות. Hoechst 33342 הוא צבע גרעיני חדיר לתא כי בקלות חוצה קרום התא להכתים DNA, המאפשר את ספירת התא הכוללת כדי להשיג. על ידי כתמים שותף עם PI, אשר רק נכנס הגרעין של תאים מתים, את חלקם של חיים (Hoechst בלבד) ומת (מוכתם בשניהם) תאים ניתן לקבוע במדויק. פרוטוקול זה מחדד את assayשפורסם 35 על ידי הוספת שלב אופטימיזציה של ריכוז הצבע (על ידי הצלבת תוצאות עם שיטת טריפאן כחול orthogonal) וצנטריפוגציה של הצלחת לפני הדמיה. מאז קווי תא רבים הם חצי דבק או מושעה, צנטריפוגציה מגדילה את חלקם של תאים התמונה ומשפר מאוד את הדיוק. ל-assay יש מספר יתרונות, כולל כתמים אלה אינם דורשים הסרת מדיה או כביסה. תערובת הצבע גם זולה, קלה להכנה ותואם למערכות צנרת רב-ערוציות/רובוטיות.
לאחר תאים כבר מוכתם, הם תמונה עם מיקרוסקופ אוטומטי. זה יש את היתרון הנוסף של יצירת רשומה קבועה של התמונות שניתן לנתח מחדש מאוחר יותר ואת ההשפעות של תרכובות מסוימות ניתן להעריך מחדש על ידי בדיקה חזותית של תמונות שנתפסו. לאחר שהושגו תמונות, ניתן לספור תאים באופן ידני או באמצעות כל אחת מחבילות תוכנה שונות, כולל הן בחינם (למשל, ImageJ, CellProfiler וכו’) ותוכנה מסחרית (לדוגמה, Metamorph, Gen5 וכו’). ספירת תאים אוטומטית עדיפה בדרך כלל מאחר שצינורות ספירת תאים אוטומטיים שפותחו כראוי מדויקים יותר ומוטה פחות מספירת תאים ידנית. הם גם מתעלמים בצורה יעילה יותר מפסולת תאים או ממתחמים לא מסיסים. פיתוח של צינורות אלה הוא בדרך כלל פשוט והוא פשוט על ידי היעילות של הכתמים בשימוש. הפלט הוא כמותי מאחר שמספר התאים המתים בפועל מחושב באופן אוטומטי ביחס למספר תא כולל, וניתן להחיל ספי סף שונים כדי להגדיל או להקטין את המחרוזת שלזיהוי 35. לנוחיותכם, נכללים פרמטרים ממוטבים לספירת תאים באמצעות Gen5 v. 3.00 תואם תוכנת Cytation 5 Cell Imaging קורא מרובה מצבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות הפרוטוקול עבור Hoechst / PI cytotoxicity assay הוא חזק ודורש זמן מעשי קטן יחסית, ישנם מספר פרטים ניסיוניים חשובים מאוד כדי להבטיח תוצאות מדויקות. ראשית, חשוב לוודא כי הריכוז של DMSO נשאר מתחת 0.5% (v /v). מוסכם בדרך כלל כי חשיפה אפילו במינונים נמוכים של DMSO יכול לשנות באופן משמעותי את מורפולוגיה וחיבור של ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, חוקר CPRIT בחקר הסרטן, מודה המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) על תמיכתם הנדיבה, CPRIT גרנט RR150044. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק המחקר של קרן וולש C-1930, ועל ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35 GM129294 שהוענק ל-NVK. למימון לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: “mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
