Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan
Summary
Le protocole décrit un essai rapide, à haut débit, fiable, peu coûteux et impartial pour déterminer efficacement la viabilité cellulaire. Cet essai est particulièrement utile lorsque les mitochondries des cellules ont été endommagées, ce qui interfère avec d’autres analyses. L’essai utilise le comptage automatisé des cellules tachées de deux teintures nucléaires – Hoechst 33342 et iodure de propidium.
Abstract
La contribution des mitochondries à la transformation oncogène fait l’objet d’un grand intérêt et d’une étude active. Comme le domaine du métabolisme du cancer devient plus complexe, l’objectif de cibler les mitochondries à l’aide de divers composés qui infligent des dommages mitochondriaux (soi-disant mitocans) devient très populaire. Malheureusement, de nombreux tests de cytotoxicité existants, tels que ceux à base de sels de tétrazolium ou de résazurine nécessitent des enzymes mitochondriques fonctionnelles pour leur performance. Les dommages infligés par les composés qui ciblent les mitochondries compromettent souvent l’exactitude de ces analyses. Ici, nous décrivons un protocole modifié basé sur la coloration différentielle avec deux colorants fluorescents, dont l’un est perméant de cellules (Hoechst 33342) et l’autre n’est pas (iodure de propidium). La différence dans la coloration permet de discriminer les cellules vivantes et mortes. L’analyse est appropriée à la microscopie automatisée et à l’analyse d’image, qui augmente le débit et réduit le biais. Cela permet également d’utiliser l’essai de façon à haut débit à l’aide de plaques de 96 puits, ce qui en fait une option viable pour les efforts de découverte de médicaments, en particulier lorsque les médicaments en question ont un certain niveau de mitotoxicité. Fait important, les résultats obtenus par Hoechst/PI colorant l’analyse montrent une cohérence accrue, à la fois avec des résultats d’exclusion bleu trypan et entre les répliques biologiques lorsque l’essai est comparé à d’autres méthodes.
Introduction
La première étape pour identifier des traitements efficaces contre le cancer est la sélection d’un essai robuste et impartial de cytotoxicité qui peut être utilisé pour examiner l’effet du traitement. Un choix commun pour les expériences à faible débit est l’exclusion du colorant bleu trypan des cellules vivantes. Cette méthode est favorisée parce qu’elle permet une méthode relativement impartiale pour quantifier la survie cellulaire. trypan bleu diffuse passivement dans les cellules dont les membranes sont compromises, mais il est effectivement bloqué d’entrer dans les cellules saines1. Le quotient des cellules vivantes et des cellules totales représente la viabilité en pourcentage, ce qui indique l’efficacité du traitement. L’inconvénient le plus important de l’essai bleu trypan est qu’il est mal adapté pour les méthodologies à haut débit. Il a un rapport signal-bruit relativement faible et une coloration prolongée peut entraîner des artefacts en raison de la coloration de cellules viables. Par conséquent, trypan exclusion bleue est généralement, mais pas toujours2, relégué au comptage manuel. Cela le rend trop lent et introduit la forte possibilité de partialité due au jugement subjectif du chercheur (à moins que des dénombrements aveuglants ou indépendants ne soient utilisés, ce qui réduit encore le débit du laboratoire). En général, le débit de cet essai est insuffisant pour la découverte moderne de médicaments.
Les analyses de viabilité, qui ont généralement un débit beaucoup plus élevé, permettent aux chercheurs de contourner cette limitation, mais viennent avec des mises en garde importantes (voir le tableau 1). Ces méthodes se regroupent généralement en deux groupes. Un groupe est composé d’analyses colorimétriques qui sont basées sur la fonction des enzymes redox cellulaires. Les substrats incolores ou non fluorescents sont convertis en produits vibrants qui peuvent être quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre. Les sels de tétrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) et la resazurine en sont des exemples classiques. Cette catégorie comprend également des analyses luminescentes qui utilisent la luciferine pour évaluer le niveau ATP. Les analyses de ce type ont la limitation sous-jacente qu’ils mesurent le métabolisme cellulaire, qui n’est pas la viabilité cellulaire en soi. Il est assez fréquent pour les cellules de devenir quiescent dans des conditions défavorables, mais conservent encore la capacité dediviser 3,4,5. Par exemple, les cellules souches cancéreuses sont souvent relativement métaboliquement quiescent6,7,8,9, et sont susceptibles d’être difficiles à faire des analyses en utilisant ces techniques. L’efficacité des traitements qui endommagent la fonction mitochondriale, comme la plupart des mitocans, est également susceptible d’être surestimée de manière significative.
Une méthodologie alternative tire parti des propriétés chimiques de diverses substances qui leur permettent de traverser ou non des membranes biologiques croisées. Un exemple sont les taches nucléaires telles que SYTOX ou propidium iodure (PI). Cette catégorie comprend également des analyses de concept similaires mais de fonction différente, comme l’essai de déshydrogénase lactate (LDH), qui mesure la libération de LDH dans le milieu extracellulaire comme indicateur de nécrose cellulaire (figure 1, tableau 1). Ces analyses sont plus capables de faire la distinction entre les cellules métaboliquement inactives et les cellules mortes.
| Analyse/colorant | Type (s) de mort cellulaire détecté | Équipement nécessaire | Caractéristiques clés |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Nécrose | Spectrophotomètre | Peu coûteux, rapide; analyse du point de terminaison; dépend de l’activité des enzymes (exclusivement mitochondriale en cas de MTT) et ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire1,10 |
| Libération de la LDH | Nécrose | Spectrophotomètre | Rapide, indépendant de l’activité des enzymes mitochondriques; coûteux pour les tests à haut débit; détecte les cellules nécrotiques avec membrane plasmatique compromisée11,12 |
| Trypan Blue (TB) | Apoptose/Nécrose | Microscope | Imperméant cellulaire; ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire; laborieux et ne convient pas au criblage à haut débit; plus difficile à utiliser avec les cellules adhérentes; sujettes au jugement subjectif de l’utilisateur, mais est considéré comme la méthode standard de mesure de la viabilité cellulaire13 |
| Orange acridine (AO) | Apoptose/Nécrose/ | Microscope à fluorescence | Un colorant d’acide nucléique avec des propriétés spectrales uniques, peut distinguer entre l’apoptose et la nécrose/nécroptose14 |
| Nécroptose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement | Perméable aux cellules; inappropriée à elle seule pour surveiller la mort cellulaire; utile pour la co-coloration; peut être utilisé pour évaluer la condensation de chromatine et la fragmentation des noyaux dans l’apoptose précoce; peut être jumelé avec de l’iodure de propidium pour distinguer l’apoptose de lanécrose 15,16 |
| Propidium Iodide (IP) | Apoptose/nécrose tardive | Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement | Intercalateur de cellule-imperméant ; détecte à la fois l’apoptose tardive et les modes de nécrose de la mortcellulaire 17. Toxique et perméable après de longues périodes d’incubation18 |
Tableau 1. Liste des analyses de cytotoxicité. Les analyses de cytotoxicité, dont certaines ont été utilisées dans cette étude, énumérées avec la brève description de leurs caractéristiques clés.
Des études récentes ont démontré que le métabolisme mitochondrial est modifié dans certains cancers19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, il a été démontré que les leucémies myéloïdes aiguës (LAM) reréglementent leur masse mitochondriale, leur teneur en MTDNA et leur respiration mitochondriale pour répondre à leursbesoins énergétiques 19,26,27. D’autre part, quelques tumeurs pleines sont caractérisées par le dysfonctionnement mitochondrique, ou plutôt la « reprogrammation métabolique », telle que la downregulation des protéines mitochondriques impliquées dans OXPHOS ou la teneur diminuée de mtDNA, qui a été associée à l’invasiveness de tumeur, au potentiel métastatique et à la résistance aux drogues apoptose-induisant28,29. En outre, récemment, il y a eu un intérêt accru en utilisant les composés mécanistes divers qui affectent la fonction mitochondrique (généralement appelée mitocans30),comme thérapies potentielles pour des cancers particuliers. Ces médicaments ciblent la synthèse ATP, l’ADN mitochondrial, oxphos, et la production de ROS, aussi bien que les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques liées aux mitochondries30,31. Plusieurs études ont montré que cette approche a une promessesignificative 19,32,33,34. Cependant, ces déviations métaboliques dans la biologie de cellules cancéreuses ou les traitements de mitochondries-ciblage peuvent affecter de manière significative des analyses conventionnelles de viabilité qui sont basées sur la fonctionnalité mitochondrique.
Ici, un protocole optimisé pour un essai différentiel de coloration nucléaire est décrit. Le protocole permet une détermination rapide et précise de la cytotoxicité des mitocans ou de leurs combinaisons avec d’autres composés. Hoechst 33342 est un colorant nucléaire perméant pour les cellules qui traverse facilement les membranes cellulaires pour tacher l’ADN, ce qui permet d’obtenir le nombre total de cellules. En co-souillant avec pi, qui n’entre que dans les noyaux des cellules mortes, la proportion de cellules vivantes (Hoechst seulement) et mortes (tachées avec les deux) cellules peut être déterminée avec précision. Ce protocole affine l’analysepubliée 35 en ajoutant une étape pour l’optimisation de la concentration de colorant (en recoupant les résultats avec la méthode orthogonale trypan bleu) et centrifugation de la plaque avant l’imagerie. Étant donné que de nombreuses lignées cellulaires sont semi-adhérentes ou suspendues, la centrifugation augmente la proportion de cellules qui sont photographiées et améliore fortement la précision. L’essai a plusieurs avantages, y compris que la coloration ne nécessite pas l’enlèvement des médias ou le lavage. Le mélange de colorant est également peu coûteux, facile à préparer et compatible avec les systèmes de pipetage multicanaux/robotiques.
Une fois que les cellules ont été tachées, elles sont photographiées à l’aide d’un microscope automatisé. Cela a l’avantage supplémentaire de créer un enregistrement permanent des images qui peuvent être ré-analysées plus tard et les effets de composés particuliers peuvent être réévalués par inspection visuelle des images capturées. Une fois que les images ont été obtenues, les cellules peuvent être comptées manuellement ou en utilisant l’un ou l’autre de plusieurs proxèmes logiciels, y compris les logiciels gratuits (p. ex., ImageJ, CellProfiler, etc.) et les logiciels commerciaux (p. ex., Metamorph, Gen5, etc.). Le comptage automatisé des cellules est généralement préférable puisque les pipelines automatisés de comptage cellulaire correctement développés sont plus précis et moins biaisés que les comptages manuels. Ils ignorent également plus efficacement les débris cellulaires ou les complexes insolubles. Le développement de ces pipelines est généralement simple et simplifié par l’efficacité des taches utilisées. La sortie est quantitative puisque le nombre réel de cellules mortes est automatiquement calculé en fonction du nombre total de cellules, et différents seuils peuvent être appliqués pour augmenter ou diminuer la rigueur de la détection35. Pour plus de commodité, des paramètres optimisés pour compter les cellules utilisant gen5 v. 3.00 logiciel compatible Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader sont inclus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le protocole d’analyse de cytotoxicité Hoechst/PI soit robuste et nécessite relativement peu de temps pratique, plusieurs détails expérimentaux sont très importants pour assurer des résultats précis. Premièrement, il est essentiel de s’assurer que la concentration de DMSO reste inférieure à 0,5 % (v/v). Il est généralement admis que l’exposition à des doses même faibles de DMSO peut modifier considérablement la morphologie et l’attachement des cellules et retarder considérablement la prog…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, un chercheur du CPRIT en recherche sur le cancer, remercie le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) pour son généreux soutien, la subvention du CPRIT RR150044. Ces travaux ont également été soutenus par la Subvention de recherche C-1930 de la Fondation Welch et par les National Institutes of Health R35 GM129294 attribués à NVK. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
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