Summary
Bu protokol, metal implant materyaline karşı kayan osteokondral silindirlerin hazırlanmasını, biyotribolojik testlerini ve analizini açıklamaktadır. Bu protokolde yer alan sonuç önlemleri metabolik aktivite, gen ekspresyonu ve histolojidir.
Abstract
Orta yaşlı hastalarda osteokondral defektler fokal metalik implantlarla tedavi edilebilir. İlk olarak diz eklemindeki bozukluklar için geliştirilen implantlar artık omuz, kalça, ayak bileği ve ilk metatarsalphalangeal eklem için kullanılabilir. Ağrı azaltma ve klinik iyileşme sağlarken, karşıt kıkırdak progresif dejeneratif değişiklikler birçok hastada görülmektedir. Bu hasara yol açan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, bir metal-on-kıkırdak eşleştirme ve eklem kıkırdağının kapsamlı analizi simüle etmek için bir tribolojik deney açıklar. Metal implant malzemesi, insan eklem kıkırdağı için bir model olarak sığır osteokondral silindirlere karşı test edilir. Farklı yükler ve sürgülü hızlar uygulanarak fizyolojik yükleme koşulları taklit edilebilir. Bu protokolde eklem kıkırdağı üzerindeki etkilerinin kapsamlı bir analizini sağlamak amacıyla histoloji, metabolik aktivite ve gen ekspresyonu analizleri açıklanmıştır. Tribolojik testlerin en büyük avantajı, yükleme parametrelerinin in vivo koşulları simüle etmek için serbestçe ayarlanabilmektir. Ayrıca, yağlama veya pro-inflamatuar ajanların etkisini araştırmak için farklı test çözümleri kullanılabilir. Kıkırdak spesifik genler ve katabolik genler için gen ekspresyonu analizi kullanılarak mekanik yüklemeye yanıt olarak eklem kondrositmetabolizmasında erken değişiklikler saptanabilir.
Introduction
Osteokondral defektlerin tedavisi zordur ve birçok durumda ameliyat gerektirir. Orta yaşlı hastalarda fokal osteokondral lezyonlar için, fokal metalik implantlar, özellikle kemik iliği stimülasyonu (BMS) veya otolog konrosit implantasyonu (ACI)1 gibi primer tedavinin başarısızlığından sonra uygun bir seçenektir. Kısmi yüzey değişimleri ağrıyı azaltmak ve hareket aralığını artırmak kurtarma prosedürleri olarak kabul edilebilir2. Bu implantlar genellikle bir CoCrMo alaşımoluşur ve normal anatomi3maç için farklı boyutlarda ve ofset yapılandırmaları mevcuttur. Başlangıçta diz medial femoral kondil kusurları için geliştirilmiş olsa da, bu tür implantlar şimdi mevcuttur ve kalça için kullanımda, ayak bileği, omuz, ve dirsek4,5,6. Tatmin edici bir sonuç için, mekanik eklem hizalaması ve karşı kıkırdak durumunu değerlendirmek çok önemlidir. Ayrıca implantın çıkıntısı olmadan doğru implantasyonun temel7olduğu gösterilmiştir.
Klinik çalışmalar ağrı azaltma ve çeşitli yerler için orta yaşlı hastalarda fonksiyonun iyileştirilmesi açısından mükemmel kısa vadeli sonuçlar gösterdi5,6,8. Allogreft implantasyonu ile karşılaştırıldığında, fokal metal implantlar erken ağırlık taşıma sağlar. Ancak, karşıt eklem kıkırdağı hastaların önemli sayıda hızlandırılmış aşınma gösterdi9,10. Bu nedenle, hatta uygun yerleştirme ile, birçok durumda yerli kıkırdak dejenerasyonu kaçınılmaz görünüyor, altta yatan mekanizmalar belirsiz liğini korurken. Kalça11 bipolar hemiartroplasti sonra benzer dejeneratif değişiklikler gözlenmiştir ve aktivite ve yükleme ile artar12.
Tribolojik deneyler bu tür eşleşmeleri in vitro olarak inceleme ve fizyolojik koşullar altında meydana gelen farklı yükleme durumlarını simüle etme olanağı sağlar13. Osteokondral pimlerin kullanımı, yerli kıkırdak veya herhangi bir implant malzemesi14'e karşı kayan eklem kıkırdağının tribolojisini araştırmak için basit bir geometri modeli sunar ve tüm eklem simülasyon modellerinde daha fazla kullanılabilir15. Metal-on-kıkırdak eşleşmeleri hızlandırılmış kıkırdak aşınmagöstermek, ekstrasellüler matris bozulması, ve bir kıkırdak-on-kıkırdak eşleştirme ile karşılaştırıldığında yüzeysel bölgede hücre canlılığı azalmış16. Kıkırdak hasarı yüzeysel ve orta bölgeler arasında delaminasyon şeklinde esas olarak oluştu17. Ancak kıkırdak dejenerasyonuna yol açan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol eklem kıkırdağının biyosentetik aktivitesinin kapsamlı bir analizini sağlar. Katabolik genlerin metabolik aktivitesi ve gen ekspresyonu düzeylerinin belirlenmesi ile kıkırdak dökümü için erken endikasyonlar saptanabilir. In vitro tribolojik deneylerin avantajı, yükleme parametrelerinin çeşitli yükleme koşullarını taklit etmek için ayarlanabilmektir.
Bu nedenle, aşağıdaki protokol deneysel bir hemiartroplasti modelini temsil eden bir metal-on-kıkırdak eşleştirme simüle etmek için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metal silindirlerin hazırlanması
- Silindirik kobalt-krom-mobibdenum (CoCrMo) çubuklarını, sağlanan değerleri doğrulamak için üreticiprotokolü başına enerji dağılımlı x-ışını spektroskopisi ile taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak kimyasal bileşimleri için cerrahi implantlar için standart spesifikasyonları karşılayan çubuklar analiz edin.
NOT: Bu deneyiçin kullanılan CoCrMo alaşımının element bileşimi %65 Co, %28 Cr, %5 Mo ve %2'dir. - Isliç 500 tane boyutu ile başlayan silikon karbür öğütme kağıdı ile örnekleri öğütmek. 4000 tane boyutuna kadar sırayla artan taşlama kağıt kullanın.
- Metalik cerrahi implantlar (ISO 5832-12:2019) ve total ve kısmi eklem protezi implantları (ISO 21534:2007) için yüzey yüzey işeyliliği tolerans düzeyi içinde olan yüzey pürüzlülüğünü elde etmek için silindiri 3 μm ve 1 μm macun ile parlatın.
NOT: Ortalama yüzey pürüzlülüğü konfokal mikroskop kullanılarak belirlenir. - CoCrMo çubukları (Ø 6 mm) 10 mm uzunluğundaki silindirlere kesin.
2. Osteokondral silindirlerin hasadı
- İskeletolgun hayvanların (kurban sırasında 18-24 aylık) sığır boğma eklemleri kullanın ve kurban dan sonra 24 saat içinde diseksiyon kadar onları kontrol ve soğutmalı tutun.
NOT: Eklemler yerel kasaptan satın alınır. Eklem diseksiyona kadar kapalı kalır. - Aseptik koşullarda silindirik osteokondral fişleri hasat etmek için, diz dezenfekte ve bir artrotomi gerçekleştirmek ve medial femoral kondile ortaya çıkarmak.
NOT: Diseksiyonu eklem yüzeyine zarar vermemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. - Eklem yüzeyini makroskopik hasarlar için inceleyin.
NOT: Kıkırdağın beyazımsı, pürüzsüz ve parlak görünümü yoksa veya kabarcık, çatlak veya daha büyük kusurlar varsa numuneyi atın. - Kesme tüpünü ağırlık taşıyan alanın eklem yüzeyine dik olarak hizalayın ve cihazı bir çekiçle sağlam vuruşlarla kıkırdak ve subkondral kemiğe doğru sürükleyin. 15 mm penetrasyon derinliğinde, cihazı ani bir hareketle saat yönünde bükün.
- Cihazı çıkarın, beyaz knob takın ve osteokondral fişin alt ucu görünene kadar vidalayın.
- Test sırasında osteokondral silindiri buna göre düzenlemek için numunelerin anteroposterior yönünü steril bir marker ile işaretleyin.
NOT: Üç boyutlu kollajen ağı ve karmaşık mimarisi eklem kıkırdağının eşsiz mekanik özelliklerini kolaylaştırır ve örneklerin yönlendirmesinde göz önünde bulundurulmalıdır. - Kan ve yağ dokusunu yıkamak için örneği fosfat tamponlu salin (PBS) ile durula.
- İstenilen sayıda osteokondral fişi (8 mm çap, 15 mm uzunluk) hasat etmek için yukarıda belirtilen adımları tekrarlayın.
NOT: Tipik olarak, 9-12 osteokondral silindir medial femoral kondile üzerinde ağırlık taşıyan alandan hasat edilebilir. - Örnekleri, antibiyotikler (penisilin 200 U/mL; streptomisin 0.2 mg/mL) ve amphotericin B 2.5 g/mL ile takviye edilmiş %10 fetal sığır serumu içeren Dulbecco'nun modifiye kartal ortamına yerleştirin ve canlılığı korumak için test edilene kadar 4 °C'de saklayın.
- Temel değerleri belirlemek için hasattan hemen sonra kontrol osteokondral fişleri analiz edin (analiz bölümüne bakın).
3. Tribolojik testler
- Bir silindir-on-plaka yapılandırma ile ticari olarak kullanılabilir karşılıklı tribometre kullanarak denemeler gerçekleştirin. Cihaz için gereksinimler dikey yükleme ve ayarlanabilir yük ve sürgülü hızdır. Ayrıca, sıvı hücre bir yağlama çözeltisi testleri gerçekleştirmek için olanak sağlar.
- Basınç ölçüm filmi kullanarak CoCrMo-on-kıkırdak sistemindeki temas basıncını belirleyin. Basınç ölçüm filmini arayüze yerleştirin ve ilk temas basıncını, temas boyutunu ve şeklini belirlemek için 30 s için statik yük uygulayın. Metal silindirin konveksiyonu ve eklem kıkırdağı sayesinde, ilk temas alanı bu konfigürasyonda eliptik bir şekle sahiptir.
NOT: Basınç ölçüm filmi, eşik basıncına ulaşılan veya aşıldığı bölgelerin kırmızı renk değişimini gösteren uygulanan basınca tepki verir. 1 N yük için, kontak basıncı tanımlanmış kontak titreşmeleri ile görsel karşılaştırma ile 2 MPa civarında belirlendi. - Alt numune tutucudaki osteokondral silindirleri sürgülü yönle hizalanmış işaretlemeyle düzeltin ve CoCrMo silindirlerini üst yük hücresine monte edin.
- Osteokondral silindirin batırışla ve metal-kıkırdak kayar arayüzünü kaplayan sıvı hücreye test çözeltisi (PBS 3 g/L hyaluronik asit le pbs) ekleyin.
- Test parametrelerini (öngörülen normal kuvvet, kontur ve sürgülü hız) ayarlayın ve test boyunca uygulanır ve korunur.
NOT: Geçiş yapan bir temas alanı (MCA) oluşturmak için karşılık veren hareketin kontur uzunluğu ilgili kişi alanına göre ayarlanmalıdır. Çapı 8 mm olan fişler için, 2 mm kontur kıkırdağın yeterli rehidrasyon sağlar. - CoCrMo silindirinin, set yükleme parametreleri ile yağlama çözeltisindeki eklem kıkırdağına karşı karşılıklı kaymaya başlayın.
- Deneyler sırasında sürtünme katsayısını (COF) izleyin.
NOT: COF otomatik olarak değerlendirilir ancak μ=F/W (μ - sürtünme katsayısı; F - sürtünme kuvveti; W - sistem tarafından uygulanan normal yük). - İstenilen test döneminden sonra denemeyi sonlandırın.
- Osteokondral fişi numune tutucudan çıkarın, PBS ile durulayın ve daha fazla biyolojik analize kadar orta derecede saklayın (aşağıya bakın).
- Test süresince test çözeltisi içinde kontrol numunelerini oda sıcaklığında batırın ve mekanik yüklemeye maruz kalmış numunelerle birlikte analiz edin.
4. Analiz
NOT: Osteokondral silindir, biyolojik aktiviteyi araştırmak için metabolik aktivite ve gen ekspresyonu için analiz edilir; histoloji kıkırdak yüzey bütünlüğü ve altta yatan matris çalışma yapılır.
- Histoloji
- Histolojik analiz için, osteokondral fişleri oda sıcaklığında %4'lük tamponlu formaldehit çözeltisine batırın.
- Örnekleri PBS ile durulayın ve plastik bir kap içine yerleştirin.
- Tüm numunelerin kapsanması için kullanıma hazır kireçgiderici çözeltisi fazlalığı ekleyin.
- Tam kireçlenme için 4 hafta boyunca sürekli ajitasyon uygulayın.
- Kireçlenmeden sonra numuneleri suda çözünen glikollere ve recinelere gömün ve −80 °C'de saklayın.
- Temas alanına transversal kriyokesit oluşturarak 6 μm kesit elde edin.
- Daha sonra, safranin O boyama ve Fastgreen karşı boyama için bir üretici protokolü kullanarak örnekleri hazırlamak.
- Bir mikroskop kullanarak histolojik görüntüleri yakalayın ve görüntüleme işleme yazılımı kullanarak işlem.
- Metabolik aktivite
NOT: Eklem kıkırdağındaki kondrositlerin metabolik aktivitesi XTT tabanlı ex vivo toksikoloji tayini ile araştırılmıştır.- PBS kullanarak osteokondral fişi durulayın ve örneği petri kabına yerleştirin.
- Bir ölçekte 24 kuyulu bir plaka yerleştirin ve ölçeği sıfırlayın.
- Tek parça halinde bir neşter ile osteokondral greft kıkırdak kesti.
- Temas alanının her iki kıkırdak parçasına eşit olarak dağıtılması ve bir buçuk ila 1 mm³ parçalar halinde kıymasının iki eşit parçaya bölünmesi için kıkırdağı ikiye bölün. İkinci yarı gen ekspresyonu analizi için kullanılır.
- Kıymalı kıkırdağı hazırlanan 24 kuyunun bir kuyusuna aktarın ve doku ağırlığını belirleyin.
- Her numune için yukarıda belirtilen adımları tekrarlayın ve plakanın her kuyuya 1 mL büyüme ortamı ekleyin.
- XTT çözeltisini (490 μL XTT etiketleme reaktifi ve 10 μL aktivasyon reaktifi) üreticinin talimatına ve karışımına göre ekleyin.
- Plakayı 37 °C'de ve %5 CO2'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra süpernatantı çıkarın ve 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tetrazolyum ürününü 24 kuyudaki kıkırdak dokusuna 0,5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek ayıklayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca sürekli ajitasyon uygulayın.
- DMSO çözümlerini çıkarın ve önceden toplanan XTT çözeltisi ile birleştirin.
- Bir plaka okuyucuüzerinde 96 kuyulu bir plaka içinde trilycates örnek 100 μL aktarın ve 492 nm bir dalga boyu ve 690 nm bir referans dalga boyu emici ölçmek.
- Ortaya çıkan emici değerleri her numunenin ıslak ağırlığına normalleştirin ve yazılımı kullanarak analiz yapın.
- Gen ekspresyonu analizi
- RNA yalıtımı
NOT: RNA izolasyonu, imalatçı tarafından verilen talimatlara göre küçük değişikliklerle ticari bir kit(Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir.- Kıyma nın ikinci yarısında elde edilen kıkırdak dokusu osteokondral fişten elde edilen küçük parçalara bölün.
- Seramik boncuklar ve 300 μL Lysis Tampon içeren bir tüpe aktarın (% 1 β-mercaptoetanol içeren).
NOT: Numuneler daha fazla işlenme tarihine kadar sıvı nitrojen içinde dondurulabilir. - 2 dk için örnekleri eritin ve doku homojenizasyonu için ticari lyser kullanın. 20 s (homojenizasyon adımı) için 6500 rpm uygulayın, her çalışmadan sonra 2 dakika soğutma fazı ile dört kez (ticari soğutma cihazını kullanarak 4 °C'de) dokuyu tamamen bozmak için.
- Her tüpe 20 μL proteinaz K ve 580 μL RNase içermeyen su ekleyin ve 55 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 10.000 x g'de 3 dk numuneleri santrifüj edin ve süpernatantı 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Her tüp ve mix% 90 etanol 0,5 hacimekleyin.
- Numunenin 700 μL'sini 2 mL toplama tüpüne yerleştirilen bir RNA bağlama sütununa ve 15 s için 8.000 x g'de santrifüje aktarın.
- Akış tan atın ve tam bir lysate için santrifüj adımını tekrarlayın.
- Sütuna 350 μL Arabellek RW1 ekleyin, 15 s için 8.000 x g'de santrifüj edin ve akış tan atın.
- 10 μL DNase stok çözeltisini ve 70 μL Arabellek RDD'yi karıştırın. RNA arıtma membranına çözeltiyi ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Sütuna 350 μL Arabellek RW1 ekleyin ve 15 s için 8.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
- 15 s için 8.000 x g tampon RPE ve santrifüj 500 μL ekleyin. Akışı atın.
- RNA arıtma sütununa 500 μL Tampon RPE ekleyin ve 2 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj ekleyin.
- Sütunu 1,5 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin ve 30 μL RNase içermeyen su ekleyin. 1 dk için 8.000 x g santrifüj.
- İzole RNA'yı cDNA sentezine kadar -80 °C'de saklayın.
- cDNA sentezi
NOT: Messenger RNA 'dan (mRNA) tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlemek için ticari bir kit (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. CDNA sentezi sırasında izole RNA stabilize etmek için bakteriyofaj MS2'den RNA eklendi.- Çözülüp reaktifleri karıştırın. Tek bir reaksiyonun bileşimi Tablo 1'degösterilmiştir.
- Tek bir reaksiyon (14°L) için ses hacmine 16°L RNA numunesi ekleyin.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termal döngüde cDNA sentezini gerçekleştirin: 25 °C'de 10 dk (astar annealing), 50 °C'de 60 dk (DNA sentezi), 85 °C'de 5 dk (denatürasyon) ve 20 °C'de 5 dk (soğutma fazı).
- CDNA'yı -20 °C'de gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonuna (RT-qPCR) kadar saklayın.
- RT-qPCR
NOT: Büyükbaş hayvan örneklerinin RT-qPCR'ı için, primerler ve problar ticari Real-Time qPCR yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır (örn. IDT) GAPDH (Glyceraldehit 3-fosfat dehidrogenaz), COL2A1 (Kollajen tip 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Kollajen tip 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinaz-1) ve MMP-13 (Matrix Metalloproteinaz-13) genleri için. Büyükbaş hayvan astarları ve çift söndürücü problar IDT tarafından sağlandı. Verimliliği ve gen ekspresyonunu değerlendirmek için tek bir reaksiyon için kullanılan reaktifler Tablo 2'de gösterilmiştir.- 96 kuyulu bir PCR plakanın her kuyusu için tek bir reaksiyonun ana karışımını (9 μL) dağıtın ve her reaksiyona 1 μL cDNA ekleyin. Üç ekik olarak her örnek için testler yapın.
- PCR plakasını sızdırmazlık yağı ve santrifüj kullanarak 877 x g'de 10 dk 4 °C'de kapatın.
- Rt-qPCR'ı aşağıdaki protokolle hassas bir termal döngü kullanarak gerçekleştirin: 10 dk için 95 °C, 45 devir amplifikasyon (10 s için 95 °C, 30 s, cDNA sentezi için annelik) ve 30 s için 37 °C.
NOT: Her astar için özel tavlama sıcaklıkları gereklidir. - Verimliliği doğrulamak için hedef genlerle birlikte GAPDH'yi kullanın.
- Her genin verimliliğini hesaplamak için sağlanan yazılımı kullanın.
- Geçiş eşiği (CT) değerlerini referans gen GAPDH'nin ifadesine göre normalleştirin ve nicelleştirme için ΔΔCT yöntemini kullanın.
- RNA yalıtımı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temas alanı ve kontak tonu bir basınç ölçüm filmi kullanılarak teyit edilmelidir(Şekil 1). Fizyolojik yükleme durumu, tanımlanmış temas basınçları için referans künyeleri ile karşılaştırılarak doğrulanabilir. Test sırasında sürtünme katsayısı sürekli olarak izlenir. Göç eden bir temas alanında, düşük sürtünme katsayısı en az 1 saat boyunca tutulabilir (Şekil 2). Safranin O kullanılarak hücre dışı matris bileşimi ve yapısı belirlenebilir (Şekil 3). Safranin O boyama yoğunluğu proteoglikan içeriği ile orantılıdır. Hızlı Yeşil non-kollajen siteleri lekeler ve Safranin O boyama net bir kontrast sağlar. Proteoglikan içeriği eklem yüzeyine göre değişir, ancak temel örneklerde doku kesiti boyunca düzgün olmalıdır(Şekil 3A). Test çözeltisine batırılmış kontrol numuneleri, mekanik yükleme ile etkisiz bir şekilde etkisiz kılabilen GAG'ların ekstraksiyonuna neden olur(Şekil 3B, 3C). Sığır eklem kondrositlerinin metabolik aktivitesi hasat alanından bağımsızdır, ancak boşaltılmış kontrollere göre mekanik yüklemede artış olduğunu göstermektedir(Şekil 4). Kıkırdak spesifik genlerin gen ekspresyonu düzeyleri (COL2A1, ACAN) fizyolojik yükleme koşulları ile artarken, katabolik genler (COL1A1 ve MMP13) sabit temas alanı ile düzenlenir(Şekil 5).
| Hacim (3l) | |
| Transkriptor RT Reaksiyonlar Tampon 5x conc. | 6 |
| Koruyucu RNase Inhibitörü 40U/μl | 0.75 |
| Deoksinükleotid Karışımı her biri 10 mM | 3 |
| Rastgele Hexamer Primer 600 μM | 3 |
| Transkripsiyon ters transkriptaz 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 g/μl) | 0.375 |
| Nükleaz içermeyen distile su | 0.125 |
| Toplam hacim | 14 |
Tablo 1: CDNA sentezi için tek bir reaksiyon için reaktifler.
| Hacim (3l) | |
| FastStart Sonda Master 2X | 5 |
| Hidroliz Probu 2,5 μM | 1 |
| Sol PrimerGAPDH 5 μM | |
| Sağ Astar GAPDH 5 μM | |
| Nükleaz içermeyen distile su | 3 |
| Toplam Master Mix | 9 |
Tablo 2: Tek bir PCR için Master Mix reaktifleri.
Şekil 1: Testten önce metal-kıkırdak arabirimindeki ilk temas alanının p ressure ölçümü. Metal silindirin konveksiyonu, eklem yüzeyi ve elastik özellikleri nedeniyle ilk temas alanı eliptiktir. Sürgülü sırasında, bu ilk temas alanı 2 mm'lik bir konturla hareket eder ve mekanik yüklemeye maruz kalan daha geniş bir alanla sonuçlanır; ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: 8 mm/s sürgülü hızda ve 1 N yükte (2 MPa temas basıncı) test edilen yedi numune için zamana bağlı sürtünme katsayısı (süre 1 saat). Her renkli çizgi bir osteokondral silindircof temsil eder. Gözlenen değişkenlik biyolojik numuneler için sınırlar içindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Safranin-O ve Hızlı Yeşil ile boyanmış büyükbaş osteokondral örneklerin histolojik kesitleri. (A) Taban çizgisi örnekleri eklem kıkırdağı boyunca yüksek GAG içeriğini gösterir. (B) Mekanik yükleme olmadan test çözeltisine batırılmış kontrol numunesi orta bölgede daha az Safranin-O boyama gösterir, proteoglikanlar ekstraksiyonu gösterir. (C) Test edilen numuneler, mekanik stimülasyon gösteren kontrollerle karşılaştırıldığında daha yüksek GAG içeriği gösterir; ölçek çubuğu = 250 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı yükleme varyasyonları ve kontrolleri ile tribolojik test sonrası sığır eklem kondrositlerinin metabolik aktivitesi. Yatay noktalı çizgi taban çizgisi düzeylerini temsil eder. Parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi test grupları arasında karşılaştırma için yapıldı ve daha sonra Dunn'ın post hoc testi anlamlı lık durumunda. *p < 0.05. Bu rakam Stotter ve ark.18'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farklı yükleme koşulları ve kontrolleri ile tribolojik test sonrası kıkırdak spesifik genlerin gen ekspresyonu. COL2A1=kollajen tip 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= kollajen tip 1; MMP13= matriks metalloproteinaz 13. İfade düzeyleri gapdh (gliserinaldehit 3-fosfat dehidrogenaz) ile normalleştirildi. Yatay noktalı çizgiler taban çizgisi ifade düzeylerini temsil emz. Parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi test grupları arasında karşılaştırma için yapıldı ve daha sonra Dunn'ın post hoc testi anlamlı lık durumunda. *p < 0.05. Bu rakam Stotter ve ark.18'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fokal metalik implantlar osteokondral defektler için bir kurtarma prosedürü temsil, özellikle orta yaşlı hastalarda ve başarısız primer tedavi sonrası. Klinik çalışmalar umut verici kısa vadeli sonuçlar gösterse de, gözlenen komplikasyonlardan biri karşıt, yerli kıkırdak10'azarar vermektir. Kadavra ve biyomekanik çalışmalar düz veya biraz gömme konumlandırma ile uygun implantasyon doğal temas basınçları korur açık kanıtlar göstermektedir19. Tribolojik deneyler çeşitli kıkırdak eşleştirmelerini in vitro olarak test etme imkanı sağlar. Bu durumda yükleme koşulları, yağlama, malzeme eşleştirmeleri ve süresi istenildiği gibi ayarlanabilir.
Sığır kıkırdağı yerel mezbahada yüksek miktarda mevcuttur. Hücresellik ve zonal yapısı çok insan femoral konfeti20benzer. Ancak, proteoglikan içeriği siteye özgüdür, gen ekspresyonu düzeyleri ise eklem yüzeyinde tek düze olduğu gösterilmiştir. Bu protokolde ağırlık taşıyan bölgeden osteokondral fişler hasat edilmiştir. Kıkırdak kalınlığı, kollajen mimarisi ve ortaya çıkan tribolojik özellikleri eklem yüzeyi üzerinde bölgesel farklılıklar göstermektedir16. Osteokondral fişlerin kollajen ağı nın bozulması ve tüm eklem modelleriile karşılaştırıldığında sıvı basınçlandırılmasının değiştirilmesi ile sınırlı bir yükleme kurulumunda kullanılmasının sınırlandırılması nın göz önünde bulundurulması gerekmektedir.
Tribolojik çalışmaların çoğunda, PBS tek başına daha sağlam veriler üretmek için test çözümü olarak kullanılır. PBS, iyotonik ozolariteli bir tampon çözeltidir ve biyolojik deneyler sırasında sabit bir pH'ın korunmasına yardımcı olur. Hyaluronik asit ile PBS kullanarak sınır yağlama ve azaltılmış sürtünmesağlar 21. Buna göre, sinovyal sıvı sürtünme katsayısını azaltır ve tuzlu22ile karşılaştırıldığında sıvı basınçlandırma geliştirir. Sürtünme katsayısı klasik Stribeck Eğrisi tarafından gösterilen çeşitli sistem özelliklerine bağlıdır. Stribeck Eğrisi sürtünme katsayısı ve viskozite, hız ve yük ile ilgilidir ve temel yağlama rejimlerini sunar: sınır, karışık ve hidrodinamik yağlama. Sınır yağlama, pbs ile tek başına yağlayıcı sıvı olarak elde edilebilir, ancak yükleme parametrelerinin buna göre ayarlanması gerekir. Testlerden teslim edilen COF, kontur üzerindeki ortalama değerlerdir. Bu nedenle, döngü sırasında farklı yağlama koşullarının meydana geldiği varsayılabilir. Geri dönüş pozisyonunda duraklama sırasında, sınır koşulları geçerli olabilir, karışık yağlama kayma sırasında baskın olabilir. Sürgülü döngüsü sırasında mutlak süreye bağlı olarak, ikincisi ortalama COF değeri üzerinde daha fazla etkiye sahip olurdu.
Günlük aktiviteler sırasında eklemlerde meydana gelen fizyolojik koşulları araştırmak için, yükleme koşulları tribometre yazılımında buna göre ayarlanabilir. İstenilen temas basınçlarını doğrulamak için basınca duyarlı ölçümler kullanılmalıdır. Bildirilen femorotibial temas basınçları arasında değişir 1 MPa ayakta sırasında ve kadar 10 MPa yokuş aşağı çalışan sırasında23. Odak yenileme ile, implant basınçları sadece biraz sağlıklı eklemler ile karşılaştırıldığındayüksektir 24. Yürüyüş döngüsü sırasında bildirilen göreceli kayma hızları 100 mm/s'ye kadar, farklı evrelerde yüksek varyasyonlar rapor edilir. Bu, göreceli eklem hareketlerinin bu tribolojik kurulumda uygulanabilecek hızları aştığı anlamına gelir. Sağlıklı diz eklemlerinde doğal kinematik koşulları ve temas basınçlarını taklit etmek için yükleme koşulları 1 ila 10 MPa temas basıncı ve 5 ila 100 mm/s sürgülü hız arasında değişir. Ancak, bu deneysel kurulumda yüksek yükler uygulanabilirken, kayar hız aralığı sınırlıdır. Hem aşırı yük hem de yetersiz yükler olan patolojik yükleme koşulları da simüle edilebilir. Düşük kayar hızlar veya statik yükleme immobilizasyonu eşitlerken, yüksek yükler fizyolojik olmayan mekanik uyarımı temsil eder.
Enzimatik sindirim kıkırdak spesifik genlerin ekspresyonunu etkileyebileceğinden, bu protokolde enzimatik olmayan doku homojenizasyonu tanımlanmıştır. CDNA sentezi sırasında, talimatlara ek olarak, bakteriyofaj MS2'den RNA stabilizasyon amacıyla eklenir. Gen ekspresyonu düzeyleri, ancak proteinler, eklem kondrositlerinin biyosentetik aktivitesindeki erken değişiklikleri saptamak için analiz edildi. Histolojik kesitler ve metabolik aktiviteye ek olarak, bu tahliller mekanik yüklemenin eklem kıkırdağı üzerindeki etkileri hakkında kapsamlı bilgi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Bu araştırma NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. tarafından finanse edilmiştir. ve Yaşam Bilimi Aramaları (Proje Kimliği: LSC15-019) ve Avusturya COMET Programı (Project K2 XTribology, Grant No. 849109) ile Aşağı Avusturya eyalet hükümeti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
