ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造
Summary
このプロトコルの目的は、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)とフィブロネクチン(FN)を用いたバイオミメティックナノマトリックス(NM)の組み立てを示すものです。ヒト間葉系幹細胞(hMCs)と共培養すると、hMSCの接着を促す優れた生理活性を示します。
Abstract
バイオミメティックNMは、幹細胞の停泊を高めることができる組織工学的な生物学的足場として機能するように開発されました。バイオミメティックNMは、水溶液中の自己集合体を介してJBNTおよびFNから形成される。JBNTは、内部疎水性中空チャネルおよび外親水性表面で200〜300 μmの長さを測定します。JBNT は正に充電され、FN は負の電荷を受けます。したがって、中性水溶液に注入すると、非共価結合を介して結合してNMバンドルを形成する。自己組立プロセスは、化学イニシエーター、熱源、またはUV光なしで数秒以内に完了します。NM溶液のpHがFNの等電点(pI 5.5-6.0)より低い場合、正に帯電したFNが存在するため、NMバンドルは自己放出します。
NMは、形態学的に細胞外マトリックス(ECM)を模倣することが知られており、したがって、注入スキャフォールドとして使用することができ、これはhMSC接着を強化するための優れたプラットフォームを提供する。細胞密度解析および蛍光イメージング実験は、NMsが陰性対照と比較してhMSCのアンカレッジを有意に増加させたことを示した。
Introduction
ヒト間葉系幹細胞(hMCs)は、異なる間葉系に沿った自己再生および自己分化の可能性を示しており、組織の再生および維持に役立つ1。分化ポテンシャルに基づいて、hMCCは間葉組織損傷および造血障害療法2の候補と考えられている。hMSCは、組織修復、血管新生、および炎症を軽減することによって創傷治癒を促進する能力を示した3。しかし、生化学的またはバイオマテリアルの援助がなければ、hMSCが目的の場所で標的組織に到達し、機能する効率は低い4である。様々な設計された足場が病変に付着するhMSCを引き付けるために利用されてきたが、成長板骨折のようないくつかの部位は、長い骨の真ん中に、不規則な形をした傷ついた部位に完全に適合しない可能性がある従来のプレハブ足場によって容易にアクセスできない。
ここでは、その場で自己集合し、標的領域に到達しにくい場所に注入できるバイオミメティックナノ材料を開発しました。注射用バイオ足場NMは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)およびフィブロネクチン(FN)で構成されています。JBNTは、ロゼットナノチューブ(RNT)とも呼ばれ、DNA塩基対、具体的にはチミンとアデニン、ここでは5、6、7に由来する。図1に示すように、ナノチューブは、6分子の由来DNA塩基が水素結合を介して自己集合して平面6を形成する際に形成される。その後、6つの分子が、最大200〜300μmの強いパイスタッキング相互作用7を介して平面に積み重ねられます。JBNTsは、FNがコラーゲン繊維と反応するように形態学的にコラーゲン繊維を模倣するように設計されています。
FNは、高分子量粘着糖タンパク質であり、これは細胞外マトリックス(ECM)9に見られる。これらは、ECMの他の成分、特にコラーゲン10への幹細胞の付着を媒介することができる。我々は、FNが非共有結合を介して数秒でNMを形成するためにそれらに反応できるように、形態学的にコラーゲン繊維を模倣するようにJBNTを設計しました。したがって、NMは、従来製造された足場ではアクセスできなかった骨折部位に注入される有望なバイオ足場である。ここで、注射可能なNMは、生体外でhMSCのアンカレッジを増強する優れた能力を提示し、組織再生のための足場として役立つ可能性を発揮する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、DNAに触発されたJBNTおよびFNで形成された自己組み立てバイオミメティックNMを開発した。JBNT溶液を調製する際には、JBNT凍結乾燥粉末は、PBSの代わりに水に溶解する必要があります。また、PBSの塩はNM繊維に束ね、画像の解像度を大幅に低下させることができるので、NMのナノフィブリル構造を観察したい場合は、NMも水中に組み立てる必要があります。
NMは?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH(グランツ1R01AR072027-01、1R03AR069383-01)、NSFキャリアアワード(1653702)、コネチカット大学によって財政的にサポートされています。
Materials
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O’Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. . U. S. Patent. , (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation – lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
