מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.
NM ביומימטי פותחה כדי לשמש פיגום ביולוגי הנדסת רקמות, אשר יכול לשפר את עגינה תאי גזע. ה- NM הביומימטי נוצר מ- JBNTs ו- FN באמצעות הרכבה עצמית בתמיסה מימית. JBNTs למדוד 200-300 מיקרומטר אורך עם ערוצי חלול הידרופובי פנימי משטחים הידרופיליים החיצוניים. JBNTs מחויבים באופן חיובי ו- FNs מחויבים באופן שלילי. לכן, כאשר מוזרק לתוך פתרון מימית ניטרלי, הם מלוכדים יחד באמצעות מליטה noncovalent כדי ליצור את חבילות NM. תהליך ההרכבה העצמית הושלם תוך שניות ספורות ללא יוזמים כימיים, מקור חום או אור UV. כאשר רמת ה- pH של פתרון NM נמוכה מהנקודה האיזואלקטרית של FNs (pI 5.5-6.0), חבילות NM יופצו באופן עצמאי עקב נוכחות של FN טעון באופן חיובי.
NM ידוע לחקות את המטריצה חוץ תאית (ECM) מורפולוגית ולכן, יכול לשמש פיגום להזרקה, אשר מספק פלטפורמה מצוינת כדי לשפר את הידבקות hMSC. ניתוח צפיפות התא וניסויי הדמיית פלואורסצנטיות הצביעו על כך שה- NMs הגדילו באופן משמעותי את העיגון של רכיבי HMSCs בהשוואה לבקרה השלילית.
תאי גזע mesenchymal האנושי (hMSCs) הראו את הפוטנציאל להתחדשות עצמית ובידול עצמי לאורך שושלת mesenchymal שונים, אשר מסייע התחדשות ותחזוקה שלרקמות 1. בהתבסס על פוטנציאל הבידול, hMSCs נחשבים כמועמדים לפציעות רקמה mesenchymal וטיפול בהפרעה hematopoietic2. hMSCs הראו את היכולת לקדם ריפוי פצעים על ידי הגדלת תיקון רקמות, אנגיוגנזה, והפחתת דלקת3. עם זאת, ללא סיוע ביוכימי או ביו-חומרים, היעילות של hMSCs להגיע לרקמת יעד ולתפקד במיקום הרצוי היא נמוכה4. למרות פיגומים מהונדסים שונים נוצלו כדי למשוך hMSCs לדבוק בנגעים, אתרים מסוימים כגון שבר צלחת צמיחה, באמצע עצם ארוכה, אינם נגישים בקלות על ידי פיגומים קונבנציונליים מראש מפוברק, אשר לא יכול להתאים באופן מושלם לתוך אתר פצוע בצורה לא סדירה.
כאן, פיתחנו ננו-חומר ביו-מימטי שיכול להרכיב את עצמו במקום ולהזריק אותו לאזור מטרה שקשה להגיע אליו. NM ביו פיגום להזרקה מורכב צינורות בסיס יאנוס (JBNTs) ו פיברונקטין (FN). JBNTs, הידוע גם בשם צינורות רוזט (RNTs), נגזרים זוגות בסיס DNA, במיוחד תימין אדנין, כאן5,6,7. כפי שניתן לראות באיור 1, הננו-צינוריות נוצרות כאשר שש מולקולות של בסיס הדנ”א הנגזר מרכיבות את עצמן באמצעות קשרי מימן ויוצרותמישור 6. שש מולקולות נערמות זו על זו במישור באמצעות אינטראקציית pi-stacking חזקה7, אשר יכול להיות עד 200-300 מיקרומטר אורך. JBNTs נועדו לחקות מורפולוגית סיבי קולגן כך FN יגיב איתם.
FN הוא דבק במשקל מולקולרי גבוה גליקופרוטאין, אשר ניתן למצוא במטריצה חוץ תאית (ECM)9. אלה יכולים לתווך את ההחזקה של תאי גזע לרכיבים אחרים של ECM, במיוחד קולגן10. עיצבנו JBNTs לחקות סיבי קולגן באופן מורפולוגי כך FN יכול להגיב איתם כדי ליצור NM בעוד כמה שניות באמצעות מליטה noncovalent. לכן, NM הוא ביו פיגום מבטיח להיות מוזרק לתוך אתר שבר עצם כי לא יכול להיות נגיש על ידי פיגומים מפוברק קונבנציונלי. כאן, NM להזרקה מציג יכולת מצוינת כדי לשפר את מעגן hMSC במבחנה, מציג את הפוטנציאל שלהם לשמש פיגום עבור התחדשות רקמות.
במחקר זה פיתחנו NM ביומימטי בהרכבה עצמית, אשר נוצר עם JBNTs בהשראת DNA ו- FN. בעת הכנת פתרון JBNT, אבקת lyophilized JBNT צריך להיות מומס לתוך המים במקום PBS כי PBS יגרום agglomeration של JBNTs, אשר מעכב את ההרכבה שלהם. יתר על כן, NM צריך גם להיות מורכב במים אם אנחנו רוצים לבחון את המבנים ננו סיבי של NM, כי המלח ב- PBS יהיה צרור ע…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת כספית על ידי NIH (מענקים 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), פרס הקריירה של NSF (1653702) ואוניברסיטת קונטיקט.
1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
96-well plate | Corning | 353072 | |
absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
silica gel | TCI America | S0821 | |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |