Tillverkning av en biomimetisk nanomatris med Janus Base Nanotuber och Fibronectin för stamcells vidhäftning

Summary

Målet med detta protokoll är att visa monteringen av en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus basnanorör (JBNTs) och fibronectin (FN). När de samkulturerade med mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) uppvisar NMs utmärkt bioaktivitet för att uppmuntra hMSCs vidhäftning.

Abstract

En biomimetisk NM utvecklades för att fungera som en vävnadsteknisk biologisk byggnadsställning, vilket kan förbättra stamcellsförankring. Biomimetiska NM bildas av JBNTs och FN genom självmontering i en vattenlösning. JBNTs mäter 200-300 μm i längd med inre hydrofoba ihåliga kanaler och yttre hydrofila ytor. JBNTs är positivt laddade och FNs debiteras negativt. Därför, när de injiceras i en neutral vattenlösning, binds de samman via icke-kovavalent bindning för att bilda NM-buntarna. Självmonteringsprocessen slutförs inom några sekunder utan kemiska initierare, värmekälla eller UV-ljus. När NM-lösningens pH är lägre än FN:s isoelektriska punkt (pI 5,5-6,0) frigörs NM-paketen på grund av förekomsten av positivt laddad FN.

NM är känt för att efterlikna den extracellulära matrisen (ECM) morfologiskt och kan därför användas som en injicerbar byggnadsställning, vilket ger en utmärkt plattform för att förbättra hMSC vidhäftning. Celldensitetsanalys och fluorescensavbildningsexperiment visade att NMs avsevärt ökade förankringen av hMSCs jämfört med den negativa kontrollen.

Introduction

Mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) har visat potentialen för självförnyelse och själv differentiering längs olika mesenchymala härstamningar, vilket hjälper till vid regenerering och underhåll av^{vävnader 1}. Baserat på differentieringspotentialen betraktas hMSCs som kandidater för mesenkymala vävnadsskador och hematopoetisk störningsbehandling². hMSCs har visat förmågan att främja sårläkning genom att öka vävnadsreparation, angiogenes och minska inflammation³. Men utan biokemisk eller biomaterialhjälp är effektiviteten för hMSCs att nå en målvävnad och funktion på önskad plats låg⁴. Även om olika konstruerade byggnadsställningar har använts för att locka hMSCs att hålla fast vid skadorna, är vissa platser såsom tillväxtplatta fraktur, i mitten av ett långt ben, inte lättillgängliga av konventionella pre-fabricerade byggnadsställningar, som kanske inte passar perfekt in i en oregelbundet formad skadad plats.

Här har vi utvecklat ett biomimetiskt nanomaterial som självmonterar på plats och injiceras till ett svårt att nå målområdet. Den injicerbara bioställningen NM består av Janus basnanorör (JBNTs) och fibronectin (FN). JBNTs, även känd som Rosette Nanotubes (RNTs), härrör från DNA-baspar, särskilt tymin och adenin, här^5,6,7. Som ses i figur 1bildas nanorören när sex molekyler av den härledda DNA-basen parar sig via vätebindningar för att bilda ett plan⁶. Sex molekyler staplas sedan på varandra i ett plan via en stark pi-stapling interaktion⁷, som kan vara upp till 200-300 μm i längd. JBNTs är utformade för att morfologiskt efterlikna kollagenfibrer så att FN kommer att reagera med dem.

FN är ett limglykoprotein med hög molekylvikt, som finns i den extracellulära matrisen (ECM)⁹. Dessa kan medla fastsättning av stamceller till andra komponenter i ECM, särskilt kollagen¹⁰. Vi designade JBNTs för att morfologiskt efterlikna kollagenfibrer så att FN kan reagera med dem för att bilda NM på några sekunder via icke-covalent bindning. Därför är NM en lovande bioställningar som ska injiceras i en benfrakturplats som inte kunde nås av de konventionellt tillverkade byggnadsställningarna. Här presenterar den injicerbara NM en utmärkt förmåga att förbättra hMSC-förankring in vitro, vilket uppvisar deras potential att fungera som en byggnadsställning för vävnadsregenerering.

Protocol

1. Syntes av JBNTs NOTERA: JBNT monomer förbereddes som publicerat tidigare11. Syntes av förening A1 Bered en lösning som innehåller 8,50 g 2-cyanoacetsyra och 9,80 g etylkarbamat i 25 ml toluen och 2,5 ml N, N-dimetylformamid. Tillsätt 4,90 ml fosforylklorid droppvis. Värm sedan blandningen till 70 °C och fortsätt omröra i 1,5 timmar. Kyl reaktionsblandningen till rumstemperatur och häll i 100 g isvatten. Extrahera vattenskiktet m…

Representative Results

Våra studier upptäckte att bildandet av NM av JBNTs och FN är snabbt, vilket hände på 10 sekunder. Som visas i figur 2erhölls vit floccule när JBNT-lösningen blandades med FN-lösningen och pipetterades flera gånger. Bildandet av NM är helt biomimetisk. Inga yttre stimuli behövs. Tillverkningsprocessen är mycket enklare än för vissa framväxande biomaterial, som är baserade på ultraviolett ljus eller kemisk initiator för korslänkning13. <p class=…

Discussion

I denna studie utvecklade vi en självmonterad biomimetisk NM, som bildades med DNA-inspirerade JBNTs och FN. Vid beredning av JBNT-lösningen bör JBNT-lyofiliiserat pulver lösas upp i vattnet istället för PBS eftersom PBS kommer att orsaka agglomeration av JBNTs, vilket hämmar deras montering. Dessutom bör NM också monteras i vatten om vi vill observera NM: s nanofibrila strukturer, eftersom saltet i PBS kommer att bunta med NM-fibrer, vilket kraftigt kan minska bildernas upplösning.

…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056