Kök Hücre Yapışması için Janus Baz Nanotüpler ve Fibronektin ile Biyomimetik Nano Matris İmalatı

Summary

Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC’ ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM’ler hMSC’lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Abstract

Kök hücre ankrajını artırabilen bir doku mühendisliği biyolojik iskelesi olarak hizmet edecek bir biyomimetik NM geliştirilmiştir. Biyomimetik NM, sulu bir çözeltide kendi kendine montaj yoluyla JBNT’lerden ve FN’den oluşturulur. JBNT’ler iç hidrofobik içi boş kanallar ve dış hidrofilik yüzeylerle 200-300 μm uzunluğundadır. JBNT’ler pozitif olarak ve FN’ler negatif olarak ücretlendirilir. Bu nedenle, nötr sulu bir çözeltiye enjekte edildiğinde, NM demetlerini oluşturmak için yaygın olmayan yapıştırma yoluyla birbirine bağlanırlar. Kendi kendine montaj işlemi, herhangi bir kimyasal başlatıcı, ısı kaynağı veya UV ışığı olmadan birkaç saniye içinde tamamlanır. NM çözeltisinin pH’ı FN’lerin izoelektrik noktasından (pI 5.5-6.0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN varlığı nedeniyle kendiliğinden serbest kalacaktır.

NM’nin hücre dışı matrisi (ECM) morfolojik olarak taklit ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, hMSC yapıştırmasını geliştirmek için mükemmel bir platform sağlayan enjekte edilebilir bir iskele olarak kullanılabilir. Hücre yoğunluğu analizi ve floresan görüntüleme deneyleri, NM’lerin negatif kontrole kıyasla hMSC’lerin ankrajını önemli ölçüde artırdığını gösterdi.

Introduction

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC’ler), dokuların yenilenmesine ve bakımına yardımcı olan farklı mezenkimal soylar boyunca kendini yenileme ve kendini farklılaştırma potansiyelini göstermiştir¹. Farklılaşma potansiyeline dayanarak, hMSC’ler mezenkimal doku yaralanmaları ve hematopoetik bozukluk tedavisi için aday olarak kabul edilir². hMSC’ler doku onarımını, anjiogenezini artırarak ve iltihabı azaltarak yara iyileşmesini teşvik etme yeteneğini göstermiştir³. Bununla birlikte, biyokimyasal veya biyomalzemeler yardımı olmadan, hMSC’lerin bir hedef dokuya ulaşması ve istenen yerde çalışması için verimlilik düşüktür⁴. Lezyonlara yapışmak için hMSC’leri çekmek için çeşitli tasarlanmış iskeleler kullanılsa da, uzun bir kemiğin ortasındaki büyüme plakası kırığı gibi bazı bölgelere, düzensiz şekilli bir yaralı bölgeye mükemmel bir şekilde sığmayan geleneksel önceden imal edilmiş iskeleler tarafından kolayca erişilemez.

Burada, kendi kendine yerinde monte edilebilen ve ulaşılması zor bir hedefe enjekte edilebilen bir biyomimetik nanomalzeme geliştirdik. Enjekte edilebilir biyo-iskele NM, Janus baz nanotüpler (JBNTs) ve fibronektinden (FN) oluşur. Rozet Nanotüpleri (RNTs) olarak da bilinen JBNT’ler, DNA baz çiftlerinden, özellikle timin ve adenden türetilir, burada^5,6,7. Şekil 1’degörüldüğü gibi, nanotüpler, türetilmiş DNA tabanının altı molekülü hidrojen bağları aracılığıyla kendi kendine birleşerek bir düzlem oluşturduğunda oluşur^6. Daha sonra altı molekül, 200-300 μm uzunluğa kadar olabilen güçlü bir pi istifleme etkileşimi⁷aracılığıyla bir düzlemde birbirlerine yığılır. JBNT’ler morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarlanmıştır, böylece FN onlarla reaksiyona girecektir.

FN, hücre dışı matriste (ECM)⁹bulunan yüksek moleküler ağırlıklı yapışkan glikoproteindir. Bunlar kök hücrelerin ECM’nin diğer bileşenlerine, özellikle kollajen^10’abağlanmasına aracılık edebilir. JBNT’leri morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarladık, böylece FN onlarla reaksiyona girerek kararsız bağlanma yoluyla birkaç saniye içinde NM oluşturabilir. Bu nedenle, NM, geleneksel olarak imal edilmiş iskeleler tarafından erişilemeyen bir kemik kırılma bölgesine enjekte edilecek umut verici bir biyo-iskeledir. Burada, enjekte edilebilir NM, doku yenilenmesi için bir iskele görevi görebilme potansiyellerini sergileyen hMSC ankraj in vitro’yu geliştirmek için mükemmel bir yetenek sunar.

Protocol

1. JBNT’lerin Sentezi NOT: JBNT monomer daha önce yayınlandı olduğu gibi hazırlanmıştır11. Bileşik A1 sentezi 25 mL toluen ve 2,5 mL N, N-dimetilformamid içinde 8,50 g 2-siyanoasetik asit ve 9,80 g etilkarbamat içeren bir çözelti hazırlayın. Damla yönünde 4,90 mL fosforel klorür ekleyin. Daha sonra karışımı 70 ° C’ye ısıtın ve 1,5 saat karıştırmaya devam edin. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutu…

Representative Results

Çalışmalarımız, JBNT ve FN’nin NM oluşumunun hızlı olduğunu keşfetti, bu da 10 saniyede gerçekleşti. Şekil 2’degösterildiği gibi, JBNT çözeltisi FN çözeltisi ile karıştırıldığında ve birkaç kez pipetlendiğinde beyaz flokül elde edildi. NM’nin oluşum süreci tamamen biyomimetiktir. Harici uyaranlara gerek yoktur. İmalat süreci, çapraz bağlantı için ultraviyole ışık veya kimyasal başlatıcıya dayanan bazı gelişmekte olan biyomalzemelerden çok daha<su…

Discussion

Bu çalışmada, DNA’dan ilham alan JBNT’ler ve FN ile oluşturulan kendi kendine monte edilmiş bir biyomimetik NM geliştirdik. JBNT çözeltisini hazırlarken, JBNT liyofilize tozu PBS yerine suya çözülmelidir, çünkü PBS, montajlarını engelleyen JBNT’lerin aglomerasyonuna neden olacaktır. Ayrıca, NM’nin nano-fibril yapılarını gözlemlemek istiyorsak NM de suda monte edilmelidir, çünkü PBS’deki tuz, görüntülerin çözünürlüğünü büyük ölçüde azaltabilecek NM lifleri ile birlikte gelecektir….

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056