Двойная прямая инъекция крови в Цистерна Магна как модель субарахноидового кровоизлияния

Summary

Мы описали в этом протоколе стандартизированную модель мыши субарахноидского кровоизлияния (SAH) путем двойной инъекции аутологичной цельной крови в цистерна-магна. Высокая степень стандартизации процедуры двойного впрыска представляет собой модель SAH со средней и острой степенью безопасности в отношении смертности.

Abstract

Среди инсультов, субарахноидового кровоизлияния (SAH) последовательных разрыву церебральной артериальной аневризмы составляет 5-9%, но отвечает за около 30% от общей смертности, связанной с инсультом с важной заболеваемости с точки зрения неврологических результатов. Задержка церебрального вазоспама (CVS) может возникать чаще всего в связи с задержкой ишемии головного мозга. Различные модели животных SAH в настоящее время используются в том числе эндоваскулярной перфорации и прямой инъекции крови в цистерна magna или даже прехиазматические цистерны, каждый из которых проявляет различные преимущества и недостатки. В этой статье представлена стандартизированная модель мыши SAH путем двойного прямого введения определенных объемов аутологичной цельной крови в цистерна-мага. Короче говоря, мышей взвешивали, а затем обезболили при вдыхании изофлурана. Затем животное было помещено в положение лежа на нагретом одеяле, поддерживая ректальную температуру 37 градусов по Цельсию и расположившись в стереотаксической раме с изгибом шейки матки около 30 градусов. После того, как на месте, кончик удлиненного стекла микропьетта заполнены гомологичной артериальной крови, взятой из сонной артерии другой мыши того же возраста и пола (C57Bl/6J) был расположен под прямым углом в контакте с атланто-затылочной мембраны с помощью микроманипулулятора. Затем 60 мл крови вводили в цистерна magna с последующим наклоном животного на 30 градусов вниз в течение 2 минут. Второй вливание 30 мл крови в цистерна-магна был выполнен 24 ч после первого. Индивидуальное наблюдение за каждым животным проводится ежедневно (тщательная оценка веса и благополучия). Эта процедура позволяет предсказуемое и высоко воспроизводимое распределение крови, вероятно, сопровождается внутричерепным повышением давления, которое может быть имитировано путем эквивалентной инъекции искусственной спинномозговой жидкости (CSF), и представляет собой острую и мягкую модель SAH вызывая низкую смертность.

Introduction

Субарахноидное кровоизлияние (SAH) составляет до 5% всех случаев инсульта и представляет собой относительно распространенную патологию с заболеваемостью от 7,2 до 9 пациентов на 100 000 в год, со смертностью 20%-60% в зависимости от исследования^1,2,3. В острой фазе смертность объясняется тяжестью кровотечения, перетечения, церебрального вазоспама (CVS) и/или медицинских осложнений^4. У выживших ранняя черепно-мозговая травма (EBI) связана с паронхимальным расширением кровоизлияния и резким увеличением внутричерепного давления, что может привести к первичной ишемии головного мозга⁵ и немедленной смерти примерно в 10%-15% случаев^6. После начальной «острой» стадии САХ прогноз зависит от возникновения «вторичной» или задержки ишемии головного мозга (ДЦП), обнаруженного почти у 40% пациентов церебральной компьютерной компьютерной компьютерной томографией, а у 80% пациентов после магнитно-резонансной томографии (МРТ)^7,,8. В дополнение к CVS происходит от 4 до 21 дней после разрыва аневризмы у большинства пациентов SAH, DCI⁹ может быть результатом многофакторных диффузных поражений головного мозга вторичного формирования микротермобоза, снижение мозгового перфузии, нейровоспаления, и коркового распространения депрессии (CSD)^10,11,12,13. Это влияет на 30% выживших SAH и влияет на когнитивные функции, включая зрительную память, вербальную память, время реакции, и исполнительной, visuospatial и языковые функции¹⁴ нарушение повседневной жизни¹⁵. Текущие стандартные методы лечения для предотвращения CVS и / или бедных когнитивных результатов у пациентов САХ основаны на блокировании Ca^{2 “сигнализации} и сосудосуживания с помощью Ca^{2 “} ингибиторы канала, как Nimodipine. Тем не менее, более поздние клинические испытания, направленные на сосудосуживающие, выявили диссоциацию между неврологическим исходом пациента и профилактикой CVS^16,что позволяет предположить более сложные патофизиологические механизмы, участвующие в долгосрочных последствиях SAH. Поэтому существует медицинская потребность в более широком понимании количества патологических явлений, сопровождающих SAH и разработки действительных и стандартизированных моделей животных для тестирования оригинальных терапевтических вмешательств.

Разрыв внутричерепной аневризмы в основном отвечает за SAH у людей, вероятно, трудно имитировать в доклинических моделей животных. В настоящее время разрыв аневризмы и SAH ситуации могут быть предварительно проверены перфорации средней мозговой артерии (эндоваскулярная модель прокола), ответственных за CVS и чувствительностиомоторных дисфункций у мышей^17,18. Из-за отсутствия какого-либо возможного контроля за наступлением кровотечения и диффузии крови в этой модели, другие методы были разработаны у грызунов для генерации моделей SAH без эндоваскулярного разрыва. Точнее, они состоят из прямого введения артериальной крови в субарахноидовое пространство через одну или двойную инъекцию в великой цистерне¹⁹ или одну инъекцию в пречиазматическую цистерну^20. Основным преимуществом этих моделей мышей без эндоваскулярного разрыва является возможность воспроизведения хирургической процедуры и качества и количества инъекционного образца крови. Еще одним преимуществом этой модели по сравнению с эндоваскулярной перфорацией, в частности, является сохранение общего благополучия животного. На самом деле, эта операция является менее инвазивным и технически менее сложным, чем требуется для создания сонной стены разрыва. В этой последней модели животное должно быть интубировано и механически проветриваемо, в то время как монофиламент вставляется во внешнюю сонную артерию и переходит во внутреннюю сонную артерию. Это, вероятно, приводит к переходной ишемии из-за обструкции сосудов по проволочной дорожке. Следовательно, со-заболеваемость (умирающее состояние, важная боль и смерть), связанная с хирургией, менее важна в модели двойной инъекции по сравнению с эндоваскулярной перфорационной моделью. В дополнение к более последовательной SAH, двойной метод прямого впрыска соответствует благополучию животных в исследованиях и тестировании (сокращенное время под наркозом, боль от нарушения тканей в хирургии и бедствия) и приводит к минимальному общему количеству животных, используемых для исследования протокола и подготовки персонала.

Кроме того, это позволяет реализовать тот же протокол для трансгенных мышей, что приводит к оптимизированному патологическому пониманию САХ и возможности сравнительного тестирования потенциальных терапевтических соединений. Здесь мы представляем стандартизированную модель мыши субарахноидального кровоизлияния (SAH) путем двойной ежедневной последовательной инъекции аутологичной артериальной крови в цистерна-мага в 6-8 недель-старый мужчина C57Bl/6J мышей. Основным преимуществом данной модели является контроль объема кровотечения по сравнению с эндоваскулярной перфорационной моделью, а также усиление кровотечения без резкого увеличения внутричерепного давления^21. В последнее время двойная прямая инъекция крови в цистерна-магна была хорошо описана на экспериментальных и физиопатологических проблем у мышей. Действительно, недавно мы продемонстрировали CVS крупных мозговых артерий (базиляр (BA), средний (MCA) и передние (ACA) мозговые артерии), цереброваскулярные фибрин осаждения и клеточного апоптоза с 3 дня (D3) до 10 (D10), дефекты циркуляции парасосудистой спинномозговой спинномозговой жидкости сопровождается измененным чувствительностью и когнитивными функциями у мышей, 10 дней после SAH в этой^{модели.} Таким образом, это делает эту модель освоенной, проверенной и охарактеризованной для краткосрочных и долгосрочных событий после SAH. Он должен быть идеально подходит для перспективного определения новых целей и для исследований по мощным и эффективным терапевтическим стратегиям против SAH-ассоциированных осложнений.

Protocol

Все процедуры были выполнены под наблюдением Х. Кастеля в соответствии с Французским комитетом по этике и руководящими принципами Директивы Европейского парламента 2010/63/EU и Совета по защите животных, используемых в научных целях. Этот проект был одобрен местными CENOMEXA и национальными к…

Representative Results

Экспериментальная хронология, процедура, наблюдение и смертностьРисунок 1A и рисунок 1B обобщают протокол модели SAH путем двойной внутринацесонной инъекции крови. Короче говоря, в первый день индукции SAH (D-1), 60 мл крови, изъятой из гомологичной ?…

Discussion

Несмотря на интенсивность исследований в области SAH и развитие терапевтических стратегий, таких как эндоваскулярные и фармакологические варианты лечения растет за последние двадцать лет, смертность остается высокой в течение первой недели госпитализации и достигает около 50% в течени…

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071