Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins
Summary
Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.
Abstract
En biologie de la reproduction, la révolution biotechnologique qui a commencé avec l’insémination artificielle et la technologie de transfert d’embryons a conduit au développement de techniques de procréation assistée telles que la maturation in vitro des ovocytes (IVM), la fécondation in vitro (FIV) et le clonage d’animaux domestiques par transfert nucléaire de cellules somatiques. IVM est la méthode particulièrement importante. C’est la technologie de plate-forme pour la fourniture d’ovocytes matures et de bonne qualité pour des applications telles que la réduction de l’intervalle de génération chez les espèces commercialement importantes ou en voie de disparition, la recherche sur la reproduction humaine in vitro, et la production d’animaux transgéniques pour les thérapies cellulaires. Le terme qualité des ovocytes inclut sa compétence pour compléter la maturation, être fécondé, ce qui entraîne une progéniture en bonne santé. Cela signifie que les ovocytes de bonne qualité sont primordiaux pour la fécondation réussie, y compris les procédures de FIV. Cela pose de nombreuses difficultés pour développer une méthode de culture fiable qui soutiendrait la croissance non seulement des ovocytes humains, mais aussi d’autres espèces de grands mammifères. La première étape de l’IVM est la culture in vitro des ovocytes. Ce travail décrit deux protocoles pour la culture 3D des ovocytes porcins. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes de modèle 3D (COC) sont encapsulés dans un réseau d’interpénétration de perles fibrine-alginate, dans lequel un mélange de fibrin et d’alginate sont gélifiés simultanément. Dans le second, les COC sont suspendus dans une goutte de particules moyennes et encapsulées avec du propylène fluoré (FEP; un copolymère d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène) pour former des microbioréacteurs définis sous le nom de marbres liquides (LM). Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant ainsi la relation fonctionnelle entre les ovocytes, et les cellules folliculaires environnantes.
Introduction
Le développement de divers systèmes culturels, y compris les systèmes tridimensionnels (3D), vise à fournir des conditions optimales pour la croissance et la maturation des ovocytes isolés des follicules, même aux premiers stades de développement. Ceci est d’une grande importance pour les techniques de procréation assistée (TAR), en particulier compte tenu du nombre croissant de femmes qui sont aux prises avec l’infertilité après le traitement du cancer1. La maturation des ovocytes dans des affections in vitro (IVM) est déjà une technique bien établie principalement utilisée pour la génération d’embryons in vitro aux fins de la reproduction du bétail2. Toutefois, chez la plupart des espèces de mammifères, même si des taux élevés de maturation des complexes cumulus-ovocytes (COC) peuvent être atteints (gamme 60 à 90 %)3, leur compétence en développement est encore insuffisante pour répondre aux besoins. C’est parce que le développement des zygotes obtenus de telle manière même jusqu’au stade blastocyste est faible et après le transfert dans les animaux de substitution leur viabilité à terme est réduite. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître la compétence développementale des embryons obtenus à partir d’ovocytes soumis à la procédure IVM4. Par conséquent, de nouveaux supports de maturation5 sont en cours d’élaboration et diverses périodes de culture in vitro sont testées6,7 avec la supplémentation des médias de culture avec divers facteurs de croissance et molécules8,9.
La première étape de tout système ivm complet est de créer des conditions optimales pour une croissance durable des ovocytes pendant la culture in vitro. La croissance des ovocytes est l’un des indicateurs spécifiques de la capacité de l’ovocyte à reprendre la méiose10,11. En outre, un système de culture in vitro approprié d’ovocytes doit être capable de soutenir sa maturation nucléaire et sa différenciation cytoplasmique12. La morphologie du complexe cumulus-oocytes est un autre indicateur important utilisé dans les cliniques de TAR pour sélectionner le meilleur ovocyte pour les étapes suivantes de la fécondation in vitro (FIV) procédure chez l’homme et le bétail12,13. Parmi les caractéristiques morphologiques des COC considérées sont: le diamètre des ovocytes, sa granulation de cytoplasme et la première intégrité du corps polaire14,15. En outre, le potentiel de développement des ovocytes est corrélé à l’apparence et au compactage des cellules cumulus et au nombre de leurs couches entourant les ovocytes. Très important pour le système approprié de culture in vitro d’ovocytes est également le maintien des cellules d’ovocyte-cumulus interactions appropriées et la stabilité de cytosquelette16,17,18,19. Jusqu’à présent, la croissance in vitro des ovocytes au sein des COC humains a été démontrée20. L’utilisation de COC de vache a également entraîné des naissances vivantes. Ceux-ci ont été isolés des follicules ovariens immatures et ensuite cultivés pendant 14 jours jusqu’à ce que l’ovocyte était suffisamment grand pour subir la procédure de FIV21. De même, les COC isolés des follicules antrals de babouin, soumis à l’IVM après la culture in vitro ont produit des ovocytes capables de réinitier la méiose au stade de la métaphase II avec une structure normale de fuseau apparaissant22. Cependant, dans cette étude, les auteurs n’ont pas essayé de les fertiliser. Néanmoins, de tels résultats indiquent qu’une procédure similaire pourrait être appliquée non seulement à ces espèces particulières de mammifères, mais aussi aux cumulus-oocytes humains obtenus à partir de follicules ce qui devrait permettre d’obtenir des ovocytes de bonne qualité adaptés à une technique de FIV réussie.
Les résultats décrits ci-dessus ont été obtenus avec l’application des protocoles conventionnels d’IVM pendant lesquels les ovocytes ont été cultivés dans les systèmes bidimensionnels (2D). La procédure de routine dans les systèmes de culture 2D couvre les ovocytes, immergés dans une goutte d’un milieu de culture approprié, avec de l’huile minérale23,24. On suppose qu’une superposition d’huile pendant la culture in vitro des ovocytes sert à prévenir l’évaporation des liquides, assurant ainsi le maintien d’un pH approprié et d’une pression osmotique dans la culture. Bien qu’un tel système de culture 2D permette d’obtenir, même jusqu’à 87% des ovocytes de porc matures25, il a été prouvé que la superposition d’huile minérale provoque une diffusion substantielle de matières liposolubles qui sont nécessaires pour le développement approprié des ovocytes26. En outre, en raison des stéroïdes (progestérone et oestrogènes) la diffusion dans l’huile minérale pendant la culture d’ovocytes, un retard de maturation nucléaire et la réduction de la réalisation de compétence développementale des ovocytes de porc a été observée. Cela peut entraîner l’obtention d’un petit nombre de zygotes, qui sont en outre caractérisés par une faible capacité de développement au stade du blastocyste et par une faible viabilité après transfert dans les animaux receveurs27. Par conséquent, des tentatives sont faites pour accroître la compétence développementale des embryons dérivés des ovocytes reçus après la procédure ivm, en créant des conditions optimales pour atteindre la maturité cytoplasmique et nucléaire des ovocytes cultivés avec des CC comme complexes, en particulier en utilisant des systèmes tridimensionnels (3D). Divers systèmes innovants de culture in vitro 3D ont été développés au cours des deux dernières décennies28,29. Ceux-ci ont été conçus pour maintenir l’organisation spatiale naturelle des cellules et pour éviter leur aplatissement dans les plats de culture ce qui ne peut pas être réalisé dans les cultures 2D traditionnelles. L’activité structurelle et fonctionnelle des COC cultivés peut être assurée par le maintien de leur architecture appropriée et la communication non perturbée par des jonctions d’écart entre les différents compartiments30. La pertinence des bio-échafaudages pour la culture in vitro 3D des complexes cumulus–oocytes a été évaluée à l’aide de biomatériaux naturels tels que divers composants de la matrice extracellulaire (ECM; collagène et acide hyaluronique)31 ou polymères inertes (alginate)32. Ces tentatives testées chez plusieurs espèces ont apporté des résultats prometteurs en termes de reprise de la méiose oocyte et la réalisation de leur pleine compétence33,34,35. Toutefois, jusqu’à présent, aucun système 3D adapté à la maturation des COC isolés des grands animaux domestiques, y compris les porcs, n’a été mis au point.
Ce travail décrit deux protocoles qui peuvent être utilisés pour la culture 3D des COC porcins. Le premier protocole décrit l’encapsulation dans les perles fibrine-alginate (FAB). FAB peut être formé par mélange simultané d’une solution d’alginate et de fibrine, qui subissent un processus synchrone de gelation. Cette combinaison offre un environnement mécanique dynamique car les deux composants contribuent à la rigidité de la matrice. Une solution similaire a été utilisée précédemment pour la culture des follicules ovariens de souris et la maturation36. Dans le cas du protocole présenté, pour éviter la dégradation prématurée du réseau alginate-fibrine, des concentrations appropriées plus élevées de solution de chlorure de calcium sont utilisées, assurant un processus de gelation rapide et stable. L’environnement mécanique dynamique crée des conditions similaires à celles-ci dans l’environnement intra-folliculaire naturel dans lequel les COC résident et augmentent en taille. En outre, les travaux montrent les résultats représentatifs des systèmes de culture 3D des COC, dans lesquels ceux-ci sont suspendus dans une goutte de milieu et encapsulés avec du propylène d’éthylène fluoré (FEP; un copolymère de particules en poudre d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène), pour former des microbioréacteurs (Billes liquides, LM). LM sont une forme de bioréacteur 3D qui ont été précédemment montrés pour soutenir, entre autres, la croissance des micro-organismes vivants37, sphéroïdes tumorales38 et cellules souches embryonnaires39. LMs ont également été utilisés avec succès pour la culture ooccytes demoutons 40. Dans la plupart des expériences utilisant des LM, les bioréacteurs ont été préparés à l’aide de polytétrafluoroéthylène (PTFE) lit en poudre avec une taille de particules de 1 μm41. Le protocole présenté utilise fep, qui est très similaire dans la composition et les propriétés aux fluoropolymères PTFE. Mais fep est plus facilement formable et plus doux que PTFE et ce qui est particulièrement important, il est très transparent.
Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant leur relation fonctionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires environnantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de maintenir la croissance in vitro non seulement des ovocytes, mais aussi des cellules cumulus qui l’entourent et en même temps soutenir sa maturation est extrêmement essentielle pour les technologies de reproduction assistée réussies et pour promouvoir la compréhension des interactions cellules somatiques/ovocytes, en particulier chez les espèces qui subissent une croissance folliculaire prolongée comme les êtres humains ou les porcs. Les techniques d’IVM continuellement améliorées deviennent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont très reconnaissants à : dr Waclaw Tworzydlo (Département de biologie du développement et morphologie des invertébrés, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université jagiellonne) pour les installations techniques en TEM; à Mme Beata Snakowska (Département d’endocrinologie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian) pour l’assistance technique; au Département de biologie cellulaire et d’imagerie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japon). Ces travaux ont été soutenus par une subvention 2018/29/N/NZ9/00983 du Centre national des sciences pologne.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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