جرثومية عن طريق الفم الرضاعة مع البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا للتحقيق في تأثير بكتيريا الأمعاء الفردية للبعوض ، بما في ذلك عزل وتحديد الميكروبات القابلة للزراعة في منتصف البعوض ، واستنزاف المضادات الحيوية لبكتيريا الأمعاء البعوض ، وإعادة إدخال نوع واحد محدد من البكتيريا.
Abstract
البعوض منتصف الموانئ الموانئ ميكروبيوم ديناميكية للغاية التي تؤثر على التمثيل الغذائي المضيف، والتكاثر، واللياقة البدنية، والكفاءة ناقلات. وقد أجريت دراسات لدراسة تأثير ميكروبات الأمعاء ككل؛ ومع ذلك، يمكن أن الميكروبات المختلفة تمارس آثار متميزة نحو المضيف. توفر هذه المقالة منهجية لدراسة تأثير كل ميكروب أمعاء البعوض المحدد والآلية المحتملة.
يحتوي هذا البروتوكول على جزأين. الجزء الأول يقدم كيفية تشريح البعوض منتصف، عزل مستعمرات البكتيريا التي يمكن تكاثرها، وتحديد أنواع البكتيريا. يوفر الجزء الثاني الإجراء الخاص بتوليد البعوض المعالج بالمضادات الحيوية وإعادة إدخال نوع واحد من البكتيريا المحددة.
Introduction
ويعتبر البعوض أن تكون أهم ناقلات الأمراض المسببة للأمراض البشرية، ونقل أكثر من مائة مسببات الأمراض بما في ذلك فيروس زيكا، فيروس حمى الضنك، والطفيليات Plasmodium 1. عندما يأخذ البعوض وجبة دم للحصول على العناصر الغذائية للوَفَس، فإنها يمكن أن تبتلع مسببات الأمراض عن طريق الخطأ من مضيف مصاب عن طريق الجهاز الهضمي2. الأهم من ذلك، فإن البعوض midgut، الذي يلعب دورا محوريا في كل من هضم وجبة الدم ومدخل الممرض، ويأوي الميكروبيوم ديناميكية للغاية3.
وقد تميزت العديد من الدراسات المختبرية التي تم تربيتها والحقول التي جمعت البعوض الميكروبية باستخدام إما طريقة تعتمد على الثقافة أو البكتيريا تسلسل المقايسة4,5,6. الأنواع بما في ذلك البانتوا، Serratia، Klebsiella، Elizabethkingia، و Enterococcus يتم عزلها عادة من البعوض في مختلف الدراسات5،7،8،9. ومن المثير للاهتمام، يتقلب ميكروبيوتا الأمعاء البعوض بشكل حيوي في كل من تنوع المجتمع وكمية أنواع البكتيريا، تتأثر بمرحلة التنمية، والأنواع، والأصل الجغرافي، وسلوك التغذية4. تشير الدراسات إلى أن تغذية الدم تزيد بشكل كبير من إجمالي الحمل البكتيري مع التوسع السريع للأنواع من Enterobacteriaceae وانخفاض في التنوع العام10،11. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم القضاء على ميكروبيوتا الأمعاء البعوض من مرحلة اليرقات عندما تخضع الحشرة للتحول أثناء ال pupation و eclosion ؛ وهكذا ، ظهرت حديثا البعوض البالغ بحاجة إلى إعادة إسكان الجراثيم4.
الأمعاء الميكروبية تعدل علم وظائف الأعضاء الحشرات في مختلف الجوانب، بما في ذلك امتصاص المغذيات، والمناعة، والتنمية، والتكاثر، والكفاءة ناقلات12. يرقات البعوض أكسينيك تفشل في التطور وراء أول إنستار في حين أن البكتيريا عن طريق الفم إنقاذ التنمية الإمدادات، مشيرا إلى أن ميكروب الأمعاء البعوض ضروري لتطوير اليرقات13,14. الى جانب ذلك، استنزاف البكتيريا الأمعاء يؤخر هضم وجبة الدم وامتصاص المغذيات، ويؤثر على نضوج البويضات، ويقلل من oviposition15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البعوض الذي يُصاب بصغر الأمعاء يثير استجابات مناعية أعلى مقارنة بالبعوض المعالج بالمضادات الحيوية ، مع تعبير ببتيد مضاد للميكروبات مرتفع باستمرار ضد مسببات الأمراض الأخرى لتصيب16. عادة ما يتم إعطاء المضادات الحيوية عن طريق الفم لإزالة بكتيريا الأمعاء في هذه الدراسات ، ثم يتم إجراء تجارب لمقارنة الفرق بين البعوض الفأس والبعوض مع الميكروبات commensal. ومع ذلك ، فإن البعوض في منتصف الغور يضم مجتمعًا متنوعًا من الميكروبات ، ويمكن لكل نوع من أنواع البكتيريا أن يمارس تأثيرًا متميزًا تجاه علم وظائف الأعضاء المضيف.
الميكروبيات البعوض ينظم كفاءة ناقلات مع آثار متباينة. الاستعمار من قبل بروتيوس معزولة عن البعوض المستمدة من الحقل من المناطق التي تتوطن حمى الضنك يمنح أعلى تنظيما التعبير الببتيد المضاد للميكروبات والمقاومة ضد عدوى فيروس حمى الضنك16. فطر entomopathogenic Beauveria bassiana ينشط المسار المناعي حصيلة وJAK-STAT ضد عدوى arbovirus17. وعلى النقيض من ذلك، فإن الفطريات Talaromyces معزولة عن Aedes aegypti midgut يسهل الإصابة بفيروس حمى الضنك عن طريق تحوير نشاط التربسين الأمعاء18. بالإضافة إلى ذلك ، Serratia marcescens يعزز انتقال الفيروس من خلال بروتين سيكريتوري يسمى SmEnhancin، الذي يهضم طبقة المخاطين على ظهارة الأمعاء من البعوض19.
يوفر هذا الإجراء طريقة منهجية وبديهية لتشريح البعوض منتصف، وعزل مستعمرات البكتيريا التي يمكن تكاثرها، وتحديد أنواع البكتيريا، وإعادة إدخالها عن طريق التغذية عن طريق الفم. وهو يوفر نتائج تمثيلية لتغذية الدم مع بكتيريا commensal، Chryseobacterium 100 1000 100،على تطور المبيض والبعوضة وovposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وجدت البحوث على التفاعلات الميكروب المضيف أن الميكروبات الأمعاء المختلفة تؤثر على علم وظائف الأعضاء المضيف من خلال آليات متباينة. هذه المادة يقدم طريقة للتحقيق في دور كل من البعوض ميكروب الأمعاء، بما في ذلك تشريح البعوض منتصف، واستزراع بكتيريا الأمعاء زراعة، والعلاج بالمضادات الحيو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 81902094، 81600497)، ومشروع خطة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة هونان (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
