En bakteriell oral fôringsanalyse med antibiotikabehandlede mygg
Summary
Denne artikkelen presenterer en protokoll for å undersøke effekten av individuelle myggtarmet bakterier, inkludert isolasjon og identifisering av mygg midgut kulterbare mikrober, antibiotikauttømming av myggtarmbakterier og gjeninnføre en bestemt bakterieart.
Abstract
Myggmidgut har et svært dynamisk mikrobiome som påvirker vertmetabolismen, reproduksjon, fitness og vektorkompetanse. Studier er utført for å undersøke effekten av tarmmikrober som helhet; Imidlertid kan forskjellige mikrober utøve tydelige effekter mot verten. Denne artikkelen gir metodikken for å studere effekten av hver enkelt myggtarmmibe og den potensielle mekanismen.
Denne protokollen inneholder to deler. Den første delen introduserer hvordan man dissekerer myggmidgut, isolerer kultivable bakteriekolonier og identifiserer bakteriearter. Den andre delen gir prosedyren for å generere antibiotikabehandlede mygg og gjeninnføre en bestemt bakterieart.
Introduction
Mygg anses å være de viktigste vektorene av menneskelige patogene sykdommer, overfører over hundre patogener, inkludert Zika-virus, Dengue-virus og Plasmodium parasitter1. Når mygg tar et blodmåltid for å skaffe næringsstoffer til oviposisjon, kan de ved et uhell innta patogener fra en smittet vert via fordøyelseskanalen2. Viktigere, myggmidgut, som spiller en avgjørende rolle i både blodmåltid fordøyelsen og patogen inngangen, havner en svært dynamisk mikrobiome3.
Flere studier har karakterisert lab-reared og feltsamlede myggmikrobiota ved hjelp av enten en kulturavhengig metode eller en bakteriesekvenseringsanalyse4,,5,,6. Arter som Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaog Enterococcus er vanligvis isolert fra mygg i ulikestudier 5,,7,,8,,9. Interessant, mygg tarm mikrobiota svinger dynamisk i både samfunnet mangfold og mengden av bakterier arter, påvirket av utviklingsstadiet, arter, geografisk opprinnelse, og fôring atferd4. Studier viser at blodfôring dramatisk øker den totale bakterielle belastningen med rask utvidelse av arter fra Enterobacteriaceae og en reduksjon i det totale mangfoldet10,11. I tillegg blir mygg tarmmikrobiota av larvalstadiet vanligvis utryddet når insektet gjennomgår metamorfose under pupering og eclosion; dermed må nylig dukket voksne mygg befolke mikrobiota4.
Gut microbiota modulerer insektfysiologi i ulike aspekter, inkludert næringsabsorpsjon, immunitet, utvikling, reproduksjon og vektorkompetanse12. Asniske mygglarver utvikler seg ikke utover den første instar mens en bakterie oral forsyning redder utvikling, noe som indikerer at myggtarmmikroben er avgjørende forlarvalutvikling 13,14. Dessuten, uttømming av tarmbakterier retards blod måltid fordøyelse og næringsabsorpsjon, påvirker oocyte modning, og reduserer oviposisjon15. I tillegg fremkaller mygg med tarmmikroflora høyere immunresponser sammenlignet med antibiotikabehandlede mygg, med stadig forhøyet antimikrobiell peptiduttrykk mot andre patogener for åinfisere 16. Antibiotika administreres vanligvis oralt for å fjerne pan tarmbakterier i disse studiene, og deretter utføres eksperimenter for å sammenligne forskjellen mellom asnic mygg og mygg med commensal mikrober. Myggmidgut har imidlertid et mangfoldig samfunn av mikrober, og hver bakterieart kan utøve en tydelig effekt mot vertens fysiologi.
Myggmikrobiota regulerer vektorkompetanse med divergerende effekter. Kolonisering av Proteus isolert fra feltavledede mygg av dengue-endemiske områder gir oppregulert antimikrobiell peptiduttrykk og motstand mot denguevirusinfeksjon16. Den entomopathogenic sopp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immunveien mot arbovirus infeksjon17. Derimot, sopp Talaromyces isolert fra Aedes aegypti midgut forenkler dengue virusinfeksjon ved å modulere gut trypsin aktivitet18. I tillegg fremmer Serratia marcescens arbovirusoverføring gjennom et sekretorisk protein kalt SmEnhancin, som fordøyer mucinlaget på tarmepitelet av mygg19.
Denne prosedyren gir en systematisk og intuitiv metode for disseksjon av myggmidgut, isolering av kultivable bakteriekolonier, identifisering av bakterieartene og gjeninnføring via oral fôring. Det gir representative resultater av blodfôring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygg eggstokkutvikling og oviposisjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskning på host-mikrobe interaksjoner har funnet at ulike tarmmikrober påvirker vertens fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikkelen introduserer metoden for å undersøke den respektive rollen som myggtarmmikrobe, inkludert dissekering av myggmidgut, kultiverering av kultiverende tarmbakterier, antibiotikabehandling og gjeninnføring av bakteriene av interesse.
For vellykket antibiotikabehandling må følgende detaljer vurderes for å gjennomføre eksperimentet. I denne protoko…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
