En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg
Summary
Denne artikel præsenterer en protokol til at undersøge effekten af de enkelte myg tarmbakterier, herunder isolering og identifikation af myg midgut kultivable mikrober, antibiotika udtynding af myg tarmbakterier, og genindføre en bestemt bakterie arter.
Abstract
Myg midgut havne en meget dynamisk mikrobiom, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og vektor kompetence. Der er gennemført undersøgelser for at undersøge virkningen af tarmmikrober som helhed; forskellige mikrober kan dog have forskellige virkninger over for værten. Denne artikel indeholder metoden til at undersøge effekten af hver enkelt myg gut mikrobe og den potentielle mekanisme.
Denne protokol indeholder to dele. Den første del introducerer, hvordan man dissekere myg midgut, isolere kultivable bakterier kolonier, og identificere bakterier arter. Den anden del giver mulighed for at generere antibiotika-behandlede myg og genindføre en bestemt bakterie arter.
Introduction
Myg anses for at være de vigtigste vektorer af humane patogene sygdomme, overføre over hundrede patogener, herunder Zika virus, Dengue virus, og Plasmodium parasitter1. Når myg tage et blodmåltid at erhverve næringsstoffer til oviposition, de kan ved et uheld indtage patogener fra en inficeret vært via fordøjelseskanalen2. Vigtigere, myg midgut, som spiller en afgørende rolle i både blod måltid fordøjelse og patogen indgang, havne en meget dynamisk mikrobiom3.
Flere undersøgelser har karakteriseret lab-opdrættet og felt-indsamlet myg mikrobiota ved hjælp af enten en kultur-afhængig metode eller en bakterie sekventering assay4,5,6. Arter, herunder Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, og Enterococcus er almindeligvis isoleret fra myg i forskelligeundersøgelser 5,,7,,8,9. Interessant, myg gut mikrobiota svinger dynamisk i både samfundet mangfoldighed og mængden af bakterier arter, påvirket af udviklingsstadiet, arter, geografisk oprindelse, og fodring adfærd4. Undersøgelser viser, at blodfodring dramatisk øger den samlede bakteriebelastning med hurtig ekspansion af arter fra Enterobacteriaceae og en reduktion i den samledemangfoldighed 10,11. Desuden er mygge gut mikrobiota af larve fase normalt udryddet, når insektet gennemgår metamorfose under pupation og eclosion; således, nyligt opstået voksne myg nødt til at genbefolke deres mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerer insekt fysiologi i forskellige aspekter, herunder næringsstof absorption, immunitet, udvikling, reproduktion, og vektor kompetence12. Axenic myg larver undlader at udvikle sig ud over den første instar, mens en bakterier oral forsyning redder udvikling, hvilket indikerer, at myg tarmmikrobe er afgørende for larveudvikling 13,,14. Udover, udtynding af tarmbakterier forsinker blod måltid fordøjelse og næringsstof absorption, påvirker oocyt modning, og nedsætter oviposition15. Desuden fremkalder myg med tarmmikroflora højere immunrespons sammenlignet med antibiotikabehandlede myg, med konstant forhøjet antimikrobielt peptid udtryk mod andre patogener til at inficere16. Antibiotika er normalt oralt administreres for at fjerne pan tarmbakterier i disse undersøgelser, og derefter eksperimenter udføres for at sammenligne forskellen mellem axenic myg og myg med commensal mikrober. Men myg midgut havne et mangfoldigt fællesskab af mikrober, og hver bakterie arter kunne udøve en særskilt effekt mod værten fysiologi.
Mosquito microbiota regulerer vektor kompetence med divergerende virkninger. Kolonisering af Proteus isoleret fra felt-afledte myg af dengue-endemiske områder giver opreguleret antimikrobiel peptid udtryk og resistens over for dengue virus infektion16. Den entomopathogenic svamp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immun vej mod arbovirus infektion17. Derimod svampen Talaromyces isoleret fra Aedes aegypti midgut letter dengue virus infektion ved modulerende gut trypsin aktivitet18. Desuden, Serratia marcescens fremmer arbovirus transmission gennem en sekretorisk protein kaldet SmEnhancin, som fordøjer mucin lag på tarm epitel af myg19.
Denne procedure giver en systematisk og intuitiv metode til dissektion af myg midgut, isolering af kultivable bakterier kolonier, identifikation af bakteriearter, og genindførelse via oral fodring. Det giver repræsentative resultater af blod fodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, om myg æggesting udvikling og oviposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskning i vært-mikrobe interaktioner har vist, at forskellige tarm mikrober påvirker deres vært fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikel introducerer metoden til at undersøge den respektive rolle myg gut mikrobe, herunder dissekere myg midgut, dyrkekultebare tarmbakterier, antibiotikabehandling, og genindføre bakterier af interesse.
For vellykket antibiotikabehandling skal følgende detaljer overvejes ved udførelsen af forsøget. I denne protokol blev myg behandlet med vatk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
