Summary
Ce protocole décrit les étapes nécessaires à l’administration du gène par l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par ultrasons focalisés, l’évaluation de l’expression génique résultante et la mesure de l’activité de neuromodulation des récepteurs chimiogénétiques par des tests histologiques.
Abstract
La chimiogénétique ciblée acoustiquement (ATAC) permet le contrôle non invasif de circuits neuronaux spécifiques. L’ATAC permet d’obtenir un tel contrôle grâce à une combinaison d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par les ultrasons focalisés (FUS-BBBO), d’administration de gènes avec des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) et d’activation de la signalisation cellulaire avec des récepteurs protéiques modifiés et chimiogénétiques et leurs ligands apparentés. Avec l’ATAC, il est possible de transduire à la fois de grandes et de petites régions du cerveau avec une précision millimétrique à l’aide d’une seule application d’ultrasons non invasive. Cette transduction peut permettre plus tard une neuromodulation à long terme, non invasive et sans dispositif chez les animaux se déplaçant librement à l’aide d’un médicament. Étant donné que le FUS-BBBO, les AAV et la chimiogénétique ont été utilisés chez de nombreux animaux, l’ATAC devrait également être évolutif pour une utilisation chez d’autres espèces animales. Cet article développe un protocole publié précédemment et décrit comment optimiser l’administration de gènes avec FUS-BBBO dans de petites régions du cerveau avec un guidage IRM, mais sans avoir besoin d’un dispositif FUS compliqué compatible avec l’IRM. Le protocole décrit également la conception de composants de ciblage et de contention de souris qui peuvent être imprimés en 3D par n’importe quel laboratoire et peuvent être facilement modifiés pour différentes espèces ou équipements personnalisés. Pour faciliter la reproductibilité, le protocole décrit en détail comment les microbulles, les AAV et la ponction veineuse ont été utilisés dans le développement de l’ATAC. Enfin, un exemple de données est présenté pour guider les investigations préliminaires des études utilisant l’ATAC.
Introduction
L’utilisation de technologies de neuromodulation spécifiques aux circuits, telles que l’optogénétique1,2 et la chimiogénétique 3,4,5, a fait progresser notre compréhension des troubles psychiatriques en tant que troubles des circuits neuronaux. Les circuits neuronaux sont difficiles à étudier et encore plus difficiles à contrôler dans le traitement des troubles cérébraux, car ils sont généralement définis par des types de cellules, des régions cérébrales, des voies de signalisation moléculaire et le moment de l’activation. Idéalement, tant pour la recherche que pour les applications cliniques, un tel contrôle devrait être exercé de manière non invasive, mais il est difficile d’obtenir une neuromodulation à la fois précise et non invasive. Par exemple, bien que les médicaments neuroactifs puissent atteindre le cerveau de manière non invasive, ils manquent de spécificité spatiale en agissant dans tout le cerveau. D’autre part, la stimulation électrique cérébrale profonde peut contrôler des régions cérébrales spécifiques, mais a du mal à contrôler des types de cellules spécifiques et nécessite une intervention chirurgicale et la mise en place d’un dispositif6.
La chimiogénétique ciblée acoustiquement7 (ATAC) fournit une neuromodulation avec une spécificité spatiale, de type cellulaire et temporelle. Il combine trois techniques : l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés (FUS-BBBO) pour le ciblage spatial, l’utilisation de vecteurs viraux adéno-associés (AAV) pour délivrer de manière non invasive des gènes sous le contrôle de promoteurs spécifiques à un type de cellule, et l’ingénierie de récepteurs chimiogénétiques pour moduler sélectivement les circuits neuronaux transfectés via l’administration de médicaments. FUS est une technologie approuvée par la FDA qui tire parti de la capacité des ultrasons à se concentrer profondément dans les tissus, y compris le cerveau humain, avec une précision spatiale millimétrique. À haute puissance, le FUS est utilisé pour l’ablation ciblée non invasive, y compris un traitement approuvé par la FDA pour le tremblement essentiel8. FUS-BBBO combine des ultrasons de faible intensité avec des microbulles administrées par voie systémique, qui oscillent dans les vaisseaux sanguins au foyer de l’échographie, ce qui entraîne une ouverture localisée, temporaire (6-24 h) et réversible de la BHE9. Cette ouverture permet l’acheminement des protéines9,10, des petites molécules11 et des vecteurs viraux 7,12,13,14 au cerveau sans dommage tissulaire significatif chez les rongeurs 10 et les primates non humains 15. Des essais cliniques sont en cours pour FUS-BBBO16,17, indiquant des applications thérapeutiques possibles de cette technique.
L’administration de gènes viraux à l’aide de l’AAV progresse également rapidement vers une utilisation clinique pour les troubles du SNC, avec les récentes approbations réglementaires de la FDA et de l’UE comme étapes majeures. Enfin, les récepteurs chimiogénétiques18, tels que les récepteurs de conception activés exclusivement par des drogues de synthèse (DREADDs), sont largement utilisés par les neuroscientifiques pour fournir un contrôle pharmacologique de l’excitation neuronale chez les animaux transgéniques ou transfectés 19,20. Les DREADD sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) qui ont été génétiquement modifiés pour répondre à des molécules chimiogénétiques synthétiques plutôt qu’à des ligands endogènes, de sorte que l’administration systémique de ces ligands augmente ou réduit l’excitabilité des neurones exprimant DREADD. Lorsque ces trois technologies sont combinées dans l’ATAC, elles peuvent être utilisées pour la modulation non invasive de circuits neuronaux sélectionnés avec une précision spatiale, de type cellulaire et temporelle.
Ici, nous développons et mettons à jour un protocole précédemment publié pour FUS-BBBO11 en incluant une méthodologie de ciblage précis des régions du cerveau avec FUS-BBBO chez la souris à l’aide d’un simple équipement de ciblage imprimé en 3D. Nous montrons également une application de FUS-BBBO à l’ATAC. Nous montrons les étapes nécessaires à l’administration d’AAV porteurs de récepteurs chimiogénétiques, et l’évaluation de l’expression génique et de la neuromodulation par histologie. Cette technique est particulièrement applicable pour cibler de grandes ou plusieurs régions du cerveau pour l’expression génique ou la neuromodulation. Par exemple, une large zone d’un cortex peut être facilement transduite avec FUS-BBBO et modulée à l’aide de la chimiogénétique. Cependant, l’administration de gènes avec une technique alternative, les injections intracrâniennes, nécessiterait un grand nombre d’injections invasives et de craniotomies. FUS-BBBO et son application, ATAC, peuvent être mis à l’échelle d’animaux de différentes tailles, où les régions du cerveau sont plus grandes et plus difficiles à cibler de manière invasive.
Protocol
Toutes les expériences ont été menées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de technologie de Californie, où les données ont été obtenues à l’origine par J.O.S.
1. Conception et impression 3D de harnais pour animaux et de matériel de guidage d’image
- Utilisez les fichiers du site Web du laboratoire Szablowski à l’adresse suivante : https://www.szablowskilab.org/downloads pour l’impression 3D des composants.
- Assurez-vous que le matériau d’impression a une faible sensibilité à l’IRM mais qu’il a un support visible à l’IRM. Voir le détail des matériaux utilisés dans la section Matériaux et réactifs.
- Tenez compte de la dégradation du matériau avec de multiples utilisations en testant le matériau à plusieurs reprises et en observant les sites d’usure qui doivent être renforcés. Assurez-vous que les parois imprimées ont une épaisseur d’au moins 2 mm.
- Utilisez des imprimantes 3D de haute précision pour améliorer la précision du ciblage.
- Contrez la gravité et d’autres forces pour éviter la déviation des composants imprimés en plastique en 3D en soutenant les composants sur toute leur longueur et en augmentant l’épaisseur des parois imprimées en 3D si une flexion est observée.
- Tenez compte de la précision dans plusieurs axes, y compris antérieur/postérieur, médial/latéral, dorsal/ventral, ainsi que le lacet, le tangage et l’inclinaison.
- Testez la précision du ciblage en effectuant FUS-BBBO et en enregistrant l’écart par rapport à la position ciblée.
- Si vous utilisez des systèmes stéréotaxiques motorisés, évaluez les effets du mouvement dynamique sur l’élasticité du matériau en enregistrant la procédure de ciblage FUS-BBBO sur vidéo, et corrigez tout écart en épaississant les parois du matériau imprimé en 3D.
2. Description de l’échographe
- Utilisez un système à ultrasons avec un transducteur à réseau annulaire à huit éléments (diamètre = 25 mm, point focal naturel = 20 mm ; ouverture (F) = 0,8)) et couplez le boîtier à la tête avec du gel à ultrasons dégazé en appliquant du gel sur la tête de souris rasée.
REMARQUE : La fréquence centrale d’un transducteur utilisé dans une étude antérieure7 était de 1,5 MHz, la durée de l’impulsion était de 10 ms et la fréquence de répétition de l’impulsion était de 1 Hz sur 120 s. Les pressions ont été calibrées à l’aide d’un hydrophone à fibre optique et maintenues entre 0,36 et 0,45 MPa. Supposons une atténuation acoustique de 18 % à travers le crâne21 pour 1,5 MHz et l’os pariétal. La gamme de conditions appropriées pour une ouverture de la BHE et une administration de l’AAV en toute sécurité a été décrite ailleurs en détail 7,14,22.
3. Préparation des animaux
- Anesthésier une souris en inhalant de l’isoflurane à 2 % avec de l’air de qualité médicale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement tactile pour confirmer l’absence de réponse. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée à l’aide d’un coton-tige stérile à usage unique pour éviter la contamination croisée du tube de pommade.
REMARQUE : La procédure typique de FUS-BBBO peut durer entre 30 minutes et 2 heures, et l’anesthésie doit être maintenue tout au long de l’intervention. - Une fois la souris anesthésiée, laver un cathéter propre avec une solution saline héparinée (10 U/ml).
REMARQUE : Un cathéter approprié pour une souris de 25 à 35 g a une aiguille de 30 G et une tubulure PE10. - Désinfectez ensuite la queue de la souris avec un tampon à 70 % d’éthanol. Placez le cathéter de la veine caudale dans une veine caudale latérale et fixez-le avec une colle à tissu. Observez un reflux de sang de la veine caudale dans le cathéter pour confirmer sa position.
- Rasez la tête de la souris, puis utilisez une crème d’épilation après le séchage de la colle tissulaire afin de réduire la possibilité que des bulles d’air soient piégées sous le gel ultrasonique pendant l’insonation.
- Placez la souris dans un chariot d’IRM imprimé en 3D, en montant les dents de devant sur une barre d’occlusion et la tête à l’intérieur d’un cône de nez (Figure 1a).
- Injecter jusqu’à 10 μL de lidocaïne par voie sous-cutanée à l’endroit où les embouts sont émoussés. Ensuite, fixez les barres émoussées au crâne et appliquez des quantités sûres de pression, en prenant soin de ne pas appliquer de pression sur la trachée car elle entrave la respiration. Observez la respiration pendant 30 s pour confirmer que l’animal respire librement à un rythme de 1/s.
- Connectez le guide de ciblage aux barres auriculaires, vérifiez la respiration comme à l’étape 3.6 (Figure 1b) et continuez à surveiller visuellement la respiration tout au long de la procédure toutes les minutes. Une fréquence respiratoire élevée au-dessus de 1/s est l’une des indications d’une perte d’anesthésie. Continuez à surveiller la réponse de pincement des orteils toutes les 5 minutes lorsque les souris ne sont pas dans le scanner IRM ou si la fréquence respiratoire est élevée au-dessus de 1/s.
- Transférez le chariot d’IRM dans un support d’IRM, puis à l’intérieur de l’alésage d’un aimant.
REMARQUE : La conception du matériel est optimisée pour une bobine de 72 mm à l’intérieur d’une IRM 7T. - Procurez-vous une séquence d’IRM pour localiser la souris dans le scanner.
- Sélectionnez la séquence de prise de vue 3D rapide en contre-plongée (FLASH) pour acquérir l’intégralité du cerveau, en utilisant les paramètres suivants, selon les instructions spécifiques du fabricant de l’instrument. Temps d’écho : 3,9 ms, Temps de répétition : 15 ms, Angle d’impulsion d’excitation : 15°, Taille de la matrice : 130 x 130 x 114, Résolution : 350 x 200 x 200 μm par voxel, Moyennes : 1, Temps d’acquisition : 3 min 42s
- Transférez les fichiers du système d’IRM vers un ordinateur contrôlant le système FUS.
- Ouvrez la séquence d’imagerie dans le logiciel pour effectuer un ciblage guidé par IRM, où l’image doit apparaître comme dans la Figure 1c.
4. Ciblage guidé par IRM
REMARQUE : Avec l’utilisation de guides de ciblage conçus sur mesure, il n’est pas nécessaire de placer un transducteur d’ultrasons dans une IRM, ni d’inciser la peau pour effectuer un ciblage par remise à zéro stéréotaxe sur les lignes bregma et lambda. Suivez les étapes ci-dessous pour effectuer le processus de ciblage.
- Placez le chariot à l’intérieur d’un instrument stéréotaxique. Fixez-le en place à l’aide d’un bloc métallique muni d’un ruban adhésif double face et en appuyant le chariot contre deux poteaux de support de l’instrument stéréotaxique.
- Transférez des images IRM vers un ordinateur équipé d’un logiciel de guidage FUS en cours d’exécution en sélectionnant des fichiers dans le gestionnaire de données, en cliquant avec le bouton droit de la souris pour afficher les options de menu et en sélectionnant « Transférer immédiatement ».
- Ouvrez le logiciel de guidage FUS et chargez l’image en cliquant sur « Ouvrir la séquence » et en chargeant tous les fichiers de la séquence d’imagerie.
- Reformatez l’image sur trois axes en appuyant sur le bouton droit de la souris et sur 'Reformater'.
- Localisez le transducteur sur le guide de ciblage circulaire (Figure 1c) en cliquant avec le bouton droit de la souris.
- En vue sagittale, ajustez la position verticale d’un transducteur virtuel pour tenir compte de l’épaisseur du bain-marie et du boîtier du transducteur (dans ce cas, 8,2 mm vers le haut, Figure 1d).
- Pointez la ou les zones à cibler dans le planificateur de trajectoire et notez les coordonnées dans une feuille de calcul (dans ce cas, le mésencéphale, comme dans la figure 1d).
- Composez la profondeur de ciblage souhaitée (valeur z dans la trajectoire électronique (Figure 2) et notez les coordonnées dans une feuille de calcul.
- Ciblez chacun des points en appuyant sur « Envoyer la trajectoire » et « Exécuter » (Figure 2).
REMARQUE : Cela se fait lorsqu’un support de souris est placé à l’intérieur des moteurs. Cependant, le même ciblage peut être obtenu avec une grande précision sur un instrument stéréotaxique. - Pour corréler les coordonnées d’une IRM avec le cadre stéréotaxique, placez le transducteur monté sur mesure sur un guide de ciblage et effectuez le déplacement jusqu’à ce que chacun des trois boulons de ciblage (Figure 3, élément A) puisse traverser à la fois le support de transducteur (Figure 3, élément B) et le guide de visée (Figure 3, élément C). Assurez-vous que les boulons ne sont pas sous tension ou inclinés.
- Décalez le transducteur de 10,56 mm vers l’avant dans le sens antérieur/postérieur jusqu’à ce qu’il soit situé au même endroit où le centre d’un guide de ciblage apparaît sur une IRM.
- Déterminez la distance entre le centre du transducteur virtuel (Figure 3a, élément A) et la région ciblée (Figure 3a, élément B) et déplacez le transducteur vers ces coordonnées à l’aide d’une trame stéréotaxique.
- Procéder à la préparation de la solution injectable.
5. Préparation de la solution injectable
REMARQUE : Les solutions de microbulles sont très sensibles à la pression. Par conséquent, un mélange vigoureux ou une injection rapide à travers des aiguilles fines peut faire s’effondrer les microbulles et réduire l’efficacité de l’ouverture de la BHE. De plus, les microbulles sont plus légères que l’eau et peuvent flotter jusqu’au sommet d’un tube, d’un cathéter ou d’une seringue (figure 4), par exemple dans un injecteur automatique. Il est fortement recommandé de remettre en suspension la solution de microbulles immédiatement avant chaque injection.
- Prélever 0,8 mL de solution saline à l’aide d’une seringue dans un tube de 1,5 mL.
- À l’aide d’une seringue, ajouter 0,1 mL d’agent de contraste IRM dans le même tube de 1,5 mL et mélanger.
- Amener la solution de microbulles23,24 non activée à température ambiante.
- Juste avant l’insonation, activez les microbulles pendant 45 s dans un dispositif d’activation de microbulles.
- Prélever lentement (sur ~3 s) 0,1 mL de microbulles à l’aide d’une seringue à tuberculine de 1 mL et d’une aiguille de 21 G à la profondeur moyenne d’un liquide.
- Ajouter 0,08 mL de microbulles dans la solution de produit de contraste et de solution saline préparée à l’étape 5.3. Mélanger en tapotant avec la main pendant 15 s.
- La concentration finale d’AAV étant de 0,5 à 2 x10 10 particules virales par gramme de poids corporel (VP/g), injecter la cargaison pour l’administration (dans ce cas AAV9) à travers une aiguille de 30 G dans le cathéter de la veine caudale, dans le cas d’ATAC – AAV porteurs de récepteurs chimiogénétiques, ou d’un témoin négatif, tel que les AAV portant GFP sous le même promoteur.
- Mélangez à nouveau les microbulles à la main pendant 15 s pour éviter qu’elles ne flottent (Figure 4).
- Immédiatement après, aspirez 200 μL de la solution de microbulles à l’aide d’une seringue sans aiguille. L’absence d’aiguille réduira les forces de cisaillement sur les microbulles.
- Retournez la seringue et mélangez en appuyant sur le piston de haut en bas.
- Fixez l’aiguille de 30 g et, toujours à l’envers, poussez lentement les microbulles jusqu’à ce que des gouttelettes apparaissent à l’extrémité d’une aiguille.
6. Procédure d’insonation
- Définissez les paramètres de l’insonation : durée d’impulsion de 10 ms, 120 répétitions, toutes les s et pression de 0,30 à 0,45 MPa au niveau du crâne.
- Retirez le guide de ciblage et appliquez du gel à ultrasons dégazé sur la tête de la souris, en veillant à ne pas former de bulles.
- Abaissez le transducteur et placez-le directement sur le support de la barre d’oreille à plat, puis composez les coordonnées dans les instruments stéréotaxiques (Figure 5).
- Injecter la solution d’AAV (0,5-2 x10 10 VP/g).
- Mélanger les microbulles et la solution de produit de contraste pour IRM pendant 15 s et injecter 80 μL par souris de 30 g.
- Appliquez immédiatement l’échographie pendant 120 s en appuyant sur 'Envoyer' et 'Exécuter'.
- Si plusieurs sites sont ciblés, déplacez la sonde vers ce site et ajustez le ciblage de profondeur en suivant les nombres dans la feuille de calcul à partir des étapes 4.7 à 4.9. Répétez ensuite les étapes 6.5 à 6.6 pour chaque site sonné.
7. Évaluation par IRM de l’ouverture de la BHE
NOTE : L’évaluation par IRM de l’ouverture de la BHE a été décrite en détail ailleurs11. L’emplacement de l’ouverture de la BHE peut être visualisé sous forme de zones plus lumineuses chez les souris qui ont reçu une injection d’un agent de contraste Gd pondéré en T1.
- Après l’application de l’échographie, enregistrez une séquence d’IRM comme à l’étape 3.10.
- Retirez la souris du scanner IRM et placez-la dans une cage de récupération pour permettre la récupération après l’anesthésie. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter des signes de détresse, de perte de poids ou d’autres critères d’évaluation humains. Consultez le personnel vétérinaire et les directives de l’IACUC de l’établissement pour procéder à tout traitement en cas d’événements indésirables inattendus.
8. Stimulation DREADD avec un ligand chimiogénétique
- Choisissez un récepteur chimiogénétique. Pour les DREADDs, choisissez le récepteur hM3Dq pour l’activation neuronale via les voies couplées Gq19, le récepteur hM4Di pour l’inhibition de l’activité neuronale via les voies couplées Gi/o20, ou le récepteur KORD pour l’activation des neurones via les voies couplées Gs à l’aide du ligand Salvinorin-B25.
- Dissoudre la clozapine-n-oxyde (CNO) dans une solution saline stérile à la concentration de 1 mg/mL. Conserver le CNO aliquote à -20 °C.
- Administrer le CNO 19, ou un autre ligand chimiogénétique26,27,28, par voie intrapéritonéale à une concentration comprise entre 0,3 et10 mg/kg.
- Si les effets de l’OIIO sur le comportement doivent être enregistrés, commencez à enregistrer l’activité comportementale dans les 15 à 45 minutes suivant l’administration du médicament pour obtenir l’activation maximale des DREADDs19.
- Si l’analyse de l’activation neuronale est souhaitée, utiliser des souris pour une évaluation histologique après 60 à 120 minutes après l’injection.
- Procéder à l’euthanasie par perfusion cardiaque (voir rubrique 9).
9. Évaluation histologique de l’expression des gènes et de l’activation chimiogénétique
REMARQUE : Une fois que le critère d’évaluation expérimental (p. ex., fin de l’étude comportementale, temps requis pour l’expression des gènes) est atteint, il est essentiel de confirmer l’emplacement et la présence de l’expression du gène.
- Après activation avec un ligand chimiogénétique, effectuer une perfusion cardiaque pour préserver les tissus.
- Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans une solution saline stérile par injection intraveineuse. Confirmez l’anesthésie avec un pincement des orteils et assurez-vous que la fréquence respiratoire a été abaissée à environ 1/s. Fournir un soutien thermique à travers le coussin chauffant jusqu’à la confirmation de l’euthanasie.
- Préparez du formol tamponné neutre (FBN) à 10 % et du PBS avec 10 unités d’héparine par mL.
REMARQUE : Les solutions doivent être à 4 °C. - Versez chaque tampon dans des tubes séparés de 50 mL et connectez-vous, puis amorcez une pompe péristaltique reliée à un cathéter papillon de 25 G avec une solution PBS/héparine.
- Attachez les membres à un tampon bleu absorbant avec du ruban adhésif et assurez-vous que l’animal est placé en position couchée sur le dos. Désinfectez la fourrure pour éviter la contamination croisée des organes périphériques au cas où ils auraient besoin d’être collectés.
- Ouvrir la cavité péritonéale par une incision transversale, exposant le diaphragme.
- Ouvrir la cage thoracique par deux coupes de ciseaux chirurgicaux le long de l’axe antérieur / postérieur.
- Exposez le cœur et placez l’aiguille dans une cavité gauche (côté droit du cœur vu en décubitus dorsal) et placez-la dans le cathéter papillon à l’étape 9.1.3.
- Faites une petite incision dans le ventricule droit pour permettre l’écoulement du sang.
- Allumez la pompe péristaltique pour commencer à évacuer le sang avec du PBS/héparine.
REMARQUE : Si cette étape n’est pas effectuée de manière adéquate, le sang coagulera lors de la fixation au formol et empêchera une perfusion appropriée. - Une fois que tout le sang est évacué et que le PBS clair commence à sortir du ventricule droit, passez l’entrée d’une pompe péristaltique à une solution de FBN et commencez la perfusion pour 25 ml par souris.
- Extraire le cerveau, le placer dans au moins 4 mL de NBF et post-fixer pendant 24 h.
- Sectionnez le cerveau à l’aide de sections coronales sur un vibratome en utilisant une épaisseur de section de 50 μm.
- Placez chaque section dans un puits d’une plaque de 24 puits stockant les sections dans tout le cerveau.
- Évaluer l’expression des récepteurs chimiogénétiques fusionnés à des protéines fluorescentes (p. ex., mCherry ou mCitrine), au microscope fluorescent afin d’identifier les sections présentant une expression pour confirmer l’emplacement. L’expression est susceptible d’être faible.
- Effectuez l’immunomarquage contre le fluorophore en suivant le protocole suivant :
- Placer 3 sections dans 0,5 mL de solution contenant 10 % de sérum d’un hôte d’un anticorps secondaire et incuber pendant 30 minutes.
- Transférez les coupes dans une solution d’anticorps primaire à une dilution de 1 :250 à 1 :1 000, en utilisant 1 :500 comme point de départ.
- Incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C dans une microplaque scellée avec un film de paraffine.
- Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois.
- Ajouter 0,5 mL par puits de la solution d’anticorps secondaire dans le sérum à 10 %.
- Incuber pendant 4 h à température ambiante.
- Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois.
- Montage sur lames avec un milieu de montage aqueux contenant une coloration nucléaire (par exemple, DAPI).
- Évaluez la localisation et la propagation à l’aide d’un microscope confocal en effectuant un balayage en tuiles d’une section entière.
- Évaluez l’intensité de l’expression en mesurant l’intensité des pixels de fluorescence dans les régions cérébrales ciblées et comparez-les à celles d’un témoin injecté par voie intracrânienne.
- Vous pouvez également évaluer le pourcentage de neurones positifs en comptant les cellules colorées par rapport aux récepteurs chimiogénétiques, par rapport aux cellules DAPI-positives ou aux marqueurs spécifiques des cellules.
- Évaluez les lésions tissulaires en effectuant une coloration à l’hématoxyline sur une section de 50 μm et en effectuant une imagerie pour détecter la perte de cellules, l’accumulation de débris cellulaires et d’autres signes de dommages importants.
- Pour évaluer la spécificité du ciblage cellulaire, effectuez un double immunomarquage comme décrit ci-dessous pour le récepteur chimiogénétique et un marqueur spécifique de la cellule. Ensuite, effectuez des comptages de cellules positives comme à l’étape 9.8.
- Placer 3 sections dans 0,5 mL d’une solution contenant 10 % de sérum d’un hôte d’un anticorps secondaire et incuber pendant 30 min.
- Transférez les coupes dans une solution d’anticorps primaire contre un marqueur fluorescent d’un récepteur chimiogénétique à une dilution de 1 :250 à 1 :1 000, en utilisant 1 :500 comme point de départ. Ajouter un deuxième anticorps primaire provenant d’une autre espèce hôte qui est ciblé contre un marqueur d’intérêt spécifique à la cellule (p. ex., CamkIIa).
- Incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C dans une microplaque scellée avec un film de paraffine.
- Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois.
- Ajouter 0,5 mL par puits de solution d’anticorps secondaires dans 10 % de sérum de l’espèce-hôte des deux anticorps secondaires.
REMARQUE : Chaque anticorps doit avoir un fluorophore distinct et doit être réactif contre les anticorps primaires à l’étape 9.10.2. - Incuber pendant 4 h à température ambiante.
- Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois.
- Monter sur des lames et fixer avec un milieu de montage aqueux contenant une coloration nucléaire.
10. Évaluer l’activation neuronale avec l’immunomarquage pour les c-Fos
- Effectuer la coloration c-Fos comme au point 9.5 de ce protocole à l’aide d’un anticorps primaire c-Fos et d’un anticorps secondaire avec un marqueur fluorescent distinct de la coloration nucléaire.
- Comptez le pourcentage de cellules qui sont positives à la fois pour le c-Fos et la coloration nucléaire dans la zone ciblée par un récepteur chimiogénétique.
- Analyser le pourcentage de noyaux c-Fos positifs dans un groupe de souris exprimant des récepteurs chimiogénétiques et traitées avec un ligand chimiogénétique ou un contrôle de véhicule et dans un groupe de souris de type sauvage traitées avec un ligand chimiogénétique ou un contrôle de véhicule.
Representative Results
La première étape de l’exécution du protocole ATAC est le ciblage du FUS-BBBO sur les régions cérébrales souhaitées. Par exemple, en suivant le protocole décrit, l’hippocampe a été ciblé avec du FUS-BBBO, et un agent de contraste et de l’AAV9 porteurs de DREADD ont été injectés aux souris, suivis d’une séquence d’IRM FLASH 3D qui acquiert des images du cerveau de la souris. Une augmentation du signal T1 a été obtenue dans la région de l’hippocampe (Figure 6) et dans d’autres parties du cerveau (Figure 7). Après plusieurs semaines, les DREADDs ont été exprimés à l’intérieur de la région cérébrale cible. Alors que de nombreux DREADD sont fusionnés à un rapporteur fluorescent (par exemple mCherry), le processus de perfusion et de fixation avec le formaldéhyde s’est avéré réduire considérablement la fluorescence de ces protéines. L’immunomarquage contre mCherry ou le DREADD a conduit à une détection plus fiable de l’expression (Figure 8) sur la base de l’expérience antérieure. Dans des expériences précédentes, ~85% des souris ont montré une expression après FUS-BBBO7. Un test simple pour des niveaux d’expression suffisants des DREADDs consiste à tester leur fonctionnalité au niveau cellulaire. Cela peut se faire, par exemple, en fournissant un ligand chimiogénétique ou un contrôle salin, tel que le CNO19, la deschloroclozapine 28, ou d’autres29, et en attendant 2 heures avant une perfusion et une fixation cardiaques. Les coupes cérébrales ont ensuite été co-immunocolorées pour la protéine c-Fos30, qui indique une activité accrue des neurones, et pour DREADD. L’expérience a été considérée comme réussie si le site du cerveau ciblé par les DREADDs présentait un nombre significativement plus élevé de noyaux neuronaux c-Fos positifs dans le groupe qui a reçu un ligand chimiogénétique par rapport au groupe qui a reçu une solution saline7 ou par rapport à un site controlatéral qui n’a pas été soumis à FUS-BBBO. Il convient de noter qu’il existe un potentiel pour certains de ces ligands d’activer les neurones de manière non spécifique sans expression de DREADDs. Par exemple, il a été démontré que le CNO est métabolisé en faibles niveaux de clozapine chez la souris, qui traverse la BHE et active les DREADDs avec une puissance élevée27. Cependant, il a également été démontré qu’il se lie à des emplacements non spécifiques. Comme dans toute expérience, il est essentiel d’inclure tous les contrôles appropriés dans les études chimiogénétiques31. Un contrôle possible est l’administration du ligand chimiogénétique à des souris de type sauvage, sans procédures, afin d’exclure les effets du médicament seul sur le test comportemental ou histologique souhaité. Un autre contrôle pourrait être l’inclusion de quatre groupes : DREADD + ligand, DREADD + véhicule, EGFP + ligand, EGFP + véhicule, ce qui expliquera les effets potentiels de l’administration du gène avec FUS-BBBO et du ligand chimiogénétique.
Figure 1 : Processus de ciblage de FUS guidé par IRM dans l’ATAC. a) Placement de la souris avec des barres auriculaires, un cône nasal et une plate-forme pouvant être insérée à l’intérieur d’un scanner IRM. b) Un guide imprimé en 3D (bleu) visible à l’IRM a été fixé aux extrémités du cadre de la barre auriculaire, puis fixé en place à l’aide d’un support d’une bobine d’IRM de surface contenant quatre boulons encliquetables (bleu semi-transparent). (c) Apparition du guide imprimé en 3D en IRM sagittale (panneau de gauche), avec un bas de la représentation virtuelle d’un transducteur aligné (demi-cercle jaune) avec le bas du guide. Le panneau de droite montre l’apparence du guide imprimé en 3D sur l’IRM à partir d’une vue coronale. Le cercle lumineux a été constitué d’un matériau de support polyjet qui présente un fort contraste IRM. La croix a été formée avec du plastique. Un cercle jaune représente l’emplacement du transducteur qui a été aligné concentriquement avec le guide à l’intérieur d’un cadre stéréotaxique. (d) Pour cibler les structures cérébrales, un transducteur virtuel a été déplacé dans la direction z au-dessus des souris pour correspondre à l’épaisseur d’un cône / boîtier d’ultrasons. Dans ce cas, en raison de l’épaisseur du bain-marie, le transducteur a été déplacé de 8,2 mm au-dessus du guide pour un ciblage précis. Les structures cérébrales ont été sélectionnées à l’aide de données d’imagerie IRM, puis leurs coordonnées IRM ont été écrites et entrées dans l’appareil stéréotaxique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Interface du logiciel utilisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Processus d’appariement de l’espace de coordonnées de l’IRM à l’instrument stéréotaxique. a) Trois trous à l’intérieur d’un support de transducteur ont été alignés avec trois trous à l’intérieur du guide d’IRM, et trois boulons de ciblage coniques ont été insérés sans provoquer de flexion de l’ensemble de l’ensemble. (b) Idéalement, les trois boulons devraient se trouver au centre des trous. c) S’il y a une imprécision dans l’alignement, les trois boulons ne s’insèrent pas, par exemple, dans le cas d’un petit lacet probablement imperceptible de 1°, un seul boulon s’insère alors que les boulons opposés sont coincés au niveau du guide IRM. Alternativement, il pourrait y avoir une flexion visible de l’ensemble de l’assemblage lorsque les boulons ont été forcés. d) Vue agrandie de l’assemblage des boulons. Les boulons doivent être placés de manière concentrique pour une meilleure précision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Redistribution rapide des microbulles à l’intérieur de la seringue. a) La seringue a été photographiée 5 s après le mélange. b) Une minute plus tard, une couche clairement visible montrait une partie du concentré de bulles près du sommet d’une seringue à tuberculine de 1 mL. Cet exemple, en particulier, utilisait une solution de microbulles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Processus de placement du centre d’un transducteur sur le centre d’un guide IRM. (a) Dans les modèles présentés dans le présent document, le support rouge a été conçu pour se déplacer de 10,56 mm vers l’avant de la position indiquée à la figure 3b à celle illustrée ici. b) Le guide bleu d’IRM a été retiré avant la sonication et un gel à ultrasons a été appliqué entre la souris et le transducteur (orange) pour assurer le passage des ultrasons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Visualisation par IRM de l’ouverture de la BHE. a) Vue axiale de l’ouverture de la BHE. La zone plus claire désignée par une pointe de flèche montre l’extravasation d’un agent de contraste IRM T1 . (b) Vue coronale de l’hippocampe dorsal et du cortex au-dessus de l’hippocampe ciblés par FUS-BBBO (pointes de flèche). (c) Vue coronale de l’hippocampe central ciblé par FUS-BBBO (pointes de flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Exemple de ciblage de 4 sites cérébraux à l’aide du système de ciblage à trois boulons décrit dans cet article. Les zones avec des pointes de flèches ont montré des sites ouverts de la BHE avec diffusion d’un agent de contraste IRM. Les quatre sites ont été ciblés successivement, avec ~150 s entre chaque ouverture de la BBB, de bas en haut. L’image a été prise dans les 2 minutes qui ont suivi la dernière ouverture de la BBB. La barre d’échelle est de 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Détection de l’expression DREADD. (a) L’immunomarquage du fluorophore attaché aux DREADDs, dans ce cas, mCherry était une méthode de détection fiable dans certaines études. (b) Dans une autre section représentative avec des DREADDs ciblant l’hippocampe en utilisant les mêmes conditions que dans (a), la fluorescence de mCherry en elle-même a produit un fort bruit de fond et un signal relativement faible. (c) Comme témoin négatif, une souris qui a reçu une injection systémique d’AAV, mais qui n’a pas subi de FUS-BBBO, a été utilisée. Aucune expression significative n’a pu être trouvée par l’immunomarquage mCherry. Les barres d’échelle sont de 500 mm. (Données en a, c adaptées de7 avec autorisations, Copyright 2020 Nature-Springer). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
L’ATAC nécessite la mise en œuvre réussie de plusieurs techniques de neuromodulation réussie de circuits neuronaux spécifiques, y compris le ciblage précis guidé par IRM, le FUS-BBBO et l’évaluation histologique de l’expression des gènes. Des composants imprimables en 3D ont été développés pour simplifier le ciblage de petites structures cérébrales avec le FUS-BBBO guidé par l’imagerie.
L’administration d’ultrasons focalisés guidés par IRM (MRIgFUS) pose un certain nombre de défis. Tout d’abord, la bobine d’IRM typique a un espace limité qui est conçu pour accueillir uniquement un échantillon et non le matériel d’échographie. Les alésages plus importants des IRM augmentent le coût de l’équipement et diminuent la qualité de l’image, car le signal est lié au facteur de remplissage d’une bobine32. Par conséquent, tout matériel FUS placé au-dessus d’une image animale en IRM compromettra la qualité de l’imagerie. Deuxièmement, la conception d’appareils compatibles avec l’IRM est difficile et coûteuse. Les matériaux compatibles avec l’IRM doivent être diamagnétiques, avoir une faible propension à créer des courants de Foucault lors de l’irradiation par radiofréquence et avoir une faible susceptibilité magnétique aux champs magnétiques élevés. Dans tout matériau conducteur, la création de courants de Foucault ou sa susceptibilité magnétique affectera également négativement la qualité de l’image. Enfin, les matériaux disponibles compatibles avec l’IRM ont des modules de Young et une durabilité inférieurs à ceux des métaux généralement utilisés dans la production de machines de ciblage précis, par exemple les cadres stéréotaxiques. Les moteurs utilisés pour les réglages de position doivent être compatibles avec l’IRM et placés à l’extérieur de l’alésage de l’IRM en raison de leur taille. Ces moteurs doivent être connectés à distance au transducteur à l’intérieur d’un alésage IRM à l’aide de matériaux compatibles IRM. Les problèmes de déformation plastique, le manque d’espace suffisant à l’intérieur de l’alésage pour mettre en œuvre des composants de taille robuste et le manque d’espace pour changer les positions de ciblage dans l’ensemble du cerveau ont affecté la précision du ciblage dans les travaux précédents.
Pour résoudre ces problèmes, il a été décidé d’effectuer une imagerie par IRM et une administration de FUS-BBBO en dehors du scanner. Pour permettre le guidage par IRM, les souris ont été placées à l’intérieur d’une contention imprimée en 3D qui avait un guide de ciblage visible par IRM qui pouvait être utilisé pour localiser les structures cérébrales de la souris à la fois dans l’IRM et dans l’espace des coordonnées de la stéréotaxe. Étant donné que le crâne de la souris et le guide de visée sont solidement fixés aux supports de la barre d’oreille (Figure 1a,b), un guide de ciblage peut être utilisé pour corréler les coordonnées spatiales dans l’image IRM et mettre à zéro les instruments stéréotaxiques. Le dispositif de retenue n’a pas de pièces mobiles et ne contient pas de transducteur, ce qui nous a permis de le rendre à la fois robuste et suffisamment petit pour tenir à l’intérieur d’une IRM et d’éliminer les interférences de signal de l’électronique du transducteur. L’espace à l’intérieur du guide de ciblage a été creusé car le support imprimé en 3D de certains matériaux est visible à l’IRM (Figure 1c). Des trous dans l’assemblage ont été introduits pour permettre l’étalonnage de la stéréotaxe (figure 3). Le transducteur à ultrasons a été fixé à un porte-électrode d’une stéréotaxe, et le ciblage a été effectué comme décrit à la section 4 (figure 1d). Le transducteur doit être soutenu sur toute sa longueur par un boîtier de barres auriculaires, empêchant toute déviation par rapport au plan de niveau. Le ciblage dans la direction dorso-ventrale peut être réalisé à l’aide de déphasages dans un réseau annulaire.
La précision pratique du ciblage est déterminée par la focalisation des ultrasons et l’atténuation du crâne. La procédure FUS-BBBO a été décrite en détail pour les rats 11 et a été mise en œuvre chez un certain nombre d’autres organismes modèles23,33,34 et chez l’homme 16,17. La relation entre la taille de la mise au point des ultrasons est inversement proportionnelle à la fréquence, où des fréquences plus élevées peuvent entraîner une diffusion plus précise. Cependant, l’atténuation du crâne augmente avec les fréquences35, ce qui peut entraîner un échauffement du crâne et des lésions des zones corticales. La stratégie de ciblage exacte dépendra du site du cerveau. Les sites où une demi-pression maximale sur toute la largeur s’insère dans le tissu cérébral permettent une ouverture prévisible et sûre de la BHE dans de nombreuses structures cérébrales telles que le striatum, le mésencéphale et l’hippocampe. Les régions proches de la base du cerveau posent un défi spécifique chez la souris. Le cerveau de la souris mesure environ 8 à 10 mm dans la direction dorso-ventrale, ce qui est comparable à la taille maximale de la moitié de la largeur de nombreux transducteurs disponibles dans le commerce. Par conséquent, le ciblage au bas du crâne peut entraîner la réflexion des ultrasons par les os et l’air présent dans les conduits auditifs, la bouche ou la trachée, ce qui peut entraîner des modèles imprévisibles de hautes et de basses pressions36. Certaines de ces pressions peuvent franchir un seuil de cavitation inertielle dont il a été démontré qu’il provoque des saignements et des lésions tissulaires37. Pour cibler les régions situées près de la base du crâne, il peut être préférable d’utiliser l’ATAC7 intersectionnel, où la génétique intersectionnelle38 est utilisée pour restreindre l’expression des gènes à une zone plus petite que celle ciblée par le faisceau FUS. Dans l’exemple publié de l’ATAC intersectionnel, un animal transgénique exprimant une enzyme d’édition de gènes (Cre38) dans des cellules dopaminergiques a été ciblé par ultrasons dans la sous-section de la région contenant des cellules dopaminergiques. Enfin, les régions corticales peuvent être ciblées par FUS, mais la diffraction et la réflexion des ultrasons peuvent se produire, ce qui entraîne des profils de pression inégaux. Ce protocole ne couvre pas le ciblage des régions corticales car il sera fortement dépendant de l’espèce utilisée ; cependant, un certain ciblage du cortex au-dessus de l’hippocampe 7 (p. ex., Figure 7) a été observé, ce qui indique qu’au moins chez la souris, c’est possible.
Le choix d’un activateur chimiogénétique et le dosage dépendront des besoins expérimentaux spécifiques. Un certain nombre d’études, y compris l’une des études des auteurs7, n’ont montré aucune réponse non spécifique significative39,40, tandis que des doses plus élevées (par exemple, 10 mg / kg) peuvent produire des effets secondaires, au moins dans certains cas41. Cependant, comme pour toutes les expériences comportementales, des contrôles appropriés31 sont essentiels en raison de l’activité non ciblée potentielle du CNO et de ses métabolites42. Ces contrôles pourraient inclure l’administration de CNO et de contrôles salins à des animaux exprimant des DREADDs et l’administration de CNO à des animaux de type sauvage ou, dans certains cas spécifiques, une comparaison des sites ipsi et controlatéraux du cerveau qui expriment respectivement et n’expriment pas les récepteurs chimiogénétiques. De plus, des recherches récentes ont révélé un certain nombre de nouveaux agonistes de DREADD avec une spécificité améliorée28,29,43. D’autres récepteurs chimiogénétiques 5,25,44 peuvent également être utilisés en conjonction avec la procédure ATAC.
L’évaluation histologique de l’expression des gènes est nécessaire post-mortem pour chaque animal. Une petite fraction d’animaux présentent une faible expression génique à la suite de FUS-BBBO7. De plus, il est nécessaire de montrer la précision spatiale et la spécificité de l’expression des gènes, car un mauvais ciblage est possible. Il convient de noter que certains AAV peuvent présenter une capacité de traçage rétrograde ou antérograde45 et peuvent provoquer une transfection loin du site ciblé par l’échographie malgré un ciblage précis par ultrasons. Si le récepteur chimiogénétique exprimé est fusionné ou co-exprime un fluorophore, l’imagerie du fluorophore dans des coupes de tissu peut être suffisante pour évaluer la localisation et l’intensité de l’expression. Cependant, de nombreuses protéines fluorescentes sont endommagées par le processus de fixation tissulaire, et l’immunomarquage de la protéine mCherry qui est fréquemment utilisée avec les DREADDs a donné un meilleur signal dans des études antérieures7. Enfin, en raison de la densité de neurones dans certaines parties du cerveau (par exemple, la couche cellulaire granulaire de l’hippocampe), l’utilisation de fluorophores localisés dans le sens nucléaire exprimés sous IRES, par opposition aux fusions, pour effectuer des comptages cellulaires peut être bénéfique puisque les noyaux peuvent être facilement segmentés et contre-colorés avec des colorants nucléaires, tels que DAPI ou TO-PRO-3. Pour évaluer la neuromodulation par coloration c-Fos, il est impératif d’effectuer une contre-coloration nucléaire et de compter les noyaux positifs c-Fos, plutôt que tout signal de fluorescence. Dans certains cas, les débris cellulaires peuvent présenter une fluorescence et fausser les mesures des cellules positives.
Les limites de l’administration de médicaments et de gènes avec FUS-BBBO comprennent une résolution inférieure à celle de l’administration avec des injections intracrâniennes invasives et la nécessité de plus grandes quantités de médicaments injectés ou de vecteurs viraux. De plus, alors qu’une injection directe dans le cerveau entraîne une administration exclusive à un site d’injection, FUS-BBBO utilise une voie intraveineuse permettant une administration possible aux tissus périphériques. Les limites de l’utilisation de la chimiogénétique pour la neuromodulation comprennent une échelle de temps lente, qui peut être inadéquate pour certains protocoles comportementaux qui nécessitent des changements rapides dans l’intensité de la neuromodulation.
Disclosures
Pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Plusieurs composants imprimés en 3D ont été conçus à l’origine par Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, France). L’auteur remercie John Heath (Caltech) et Margaret Swift (Caltech) pour leur aide technique dans la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
