Abordagem genética de frente de células vivas para identificar e isolar mutantes do desenvolvimento em trachomatis de clamídia
Summary
Este protocolo utiliza promotores-repórteres fluorescentes, microscopia de células vivas e extração de inclusão individual em uma abordagem genética direcionada para identificar e isolar mutantes de desenvolvimento da Clamídia trachomatis.
Abstract
O patógeno bacteriano intracelular Chlamydia trachomatis passa por um ciclo de desenvolvimento composto por duas formas de desenvolvimento morfologicamente discretas. O corpo elementar não replicativo (EB) inicia a infecção do hospedeiro. Uma vez dentro, o EB se diferencia no corpo reticulado (RB). O RB então passa por várias rodadas de replicação, antes de diferenciar de volta à forma infecciosa EB. Este ciclo é essencial para a sobrevivência do clamídia, pois a falha no alternamento entre os tipos de células evita a invasão ou a replicação do hospedeiro.
Limitações nas técnicas genéticas devido à natureza intracelular obrigatória da Clamídia têm dificultado a identificação dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do tipo celular. Projetamos um novo sistema plasmídeo duplo promotor-repórter que, em conjunto com a microscopia de células vivas, permite a visualização da troca do tipo celular em tempo real. Para identificar genes envolvidos na regulação do desenvolvimento do tipo celular, o sistema promotor-repórter de células vivas foi aproveitado para o desenvolvimento de uma abordagem genética avançada, combinando mutagênese química da cepa de dois repórteres, imagem e rastreamento da Clamídia com cinética de desenvolvimento alterada, seguida pelo isolamento clonal de mutantes. Este fluxo de trabalho genético avançado é uma ferramenta flexível que pode ser modificada para interrogatório direcionado em uma ampla gama de vias genéticas.
Introduction
Clamídia trachomatis (Ctr) é um patógeno intracelular obrigatório que progride através de um ciclo de desenvolvimento bifásico que é essencial para sua sobrevivência e proliferação1. Este ciclo consiste em duas formas de desenvolvimento, o corpo elementar (EB) e o corpo reticulado (RB). O EB é replicação incompetente, mas media a invasão celular através da endocitose induzida por efeito2. Uma vez no host, o EB amadurece para o RB replicativo. O RB realiza várias rodadas de replicação antes de converter de volta para o EB, a fim de iniciar rodadas subsequentes de infecção.
A matriz limitada de ferramentas genéticas restringiu a maior parte da pesquisa clamídica a estudos bioquímicos ou ao uso de sistemas substitutos. Como consequência, a elucidação da regulação genética e o controle do ciclo de desenvolvimento tem sido difícil3,4. Um dos desafios mais importantes no campo clamídico é o rastreamento temporal de alta resolução do ciclo de desenvolvimento clamídico e a identificação das proteínas envolvidas em sua regulação. A expressão genética durante o ciclo de desenvolvimento da clamídia tem sido tradicionalmente realizada por métodos destrutivos de “ponto final”, incluindo RNAseq, qPCR e microscopia celular fixa5,,6. Embora esses métodos tenham fornecido informações inestimáveis, as técnicas empregadas são laboriosas e têm baixa resolução temporal5,6.
Na última década, a manipulação genética da CTR progrediu com a introdução da transformação plasmida e dos métodos para mutagênese7,,8,,9. Para este estudo, foi desenvolvido um sistema baseado em plasmídeos para monitorar o desenvolvimento clamídia em inclusões individuais em tempo real ao longo de uma infecção. Foi criado um transformador clamídial que expressou um promotor-repórter específico do tipo RB e EB. O repórter específico da RB foi construído fundindo o promotor do antigo gene RB euo upstream da proteína fluorescente Clover. EuO é um regulador transcricional que reprime um subconjunto de genes associados ao EBtardios 10. O promotor do hctB, que codifica uma proteína semelhante a histona envolvida na condensação nucleóide EB, foi clonado diretamente a montante de mKate2 (RFP) para criar o repórter específico do EB11. A espinha dorsal do hctBprom-mKate2/euoprom-Clover foi p2TK2SW27. Os promotores hctB e euo foram amplificados a partir do DNA genômico Ctr-L2. Cada sequência de promotor consistia de ~100 pares base a montante do local de início de transcrição previsto para o gene clamídico especificado mais os primeiros 30 nucleotídeos (10 aminoácidos) do respectivo ORF. As variantes fluorescentes fp foram obtidas comercialmente como blocos genéticos otimizados pelo códon ctr e clonadas em quadro com os primeiros 30 nucleotídeos de cada gene e promotor clamídial. O exterminador incD foi clonado diretamente rio abaixo de mKate2. O segundo promotor-repórter foi inserido a jusante do exterminador do incD. O gene de resistência à ampicilina(bla) em p2TK2SW2 foi substituído pelo gene aadA (resistência à espectroicina) do pBam4. Isso resultou na construção final p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) que foi transformada em Ctr-L27.hctB Esta cepa de repórter RB/EB permitiu a observação do ciclo de desenvolvimento dentro de inclusões únicas utilizando microscopia de células vivas (Figura 1B,C).
Empregando nossa construção promotor-repórter em combinação com mutagênese química, um protocolo foi criado para rastrear e isolar clones individuais que exibiam anormalidades no desenvolvimento de populações mutagenizadas de Ctr serovar L2. Este protocolo permite o monitoramento direto de inclusões croniaxias individuais, o rastreamento dos perfis de expressão genética ao longo do tempo, a identificação de clones clamídias que expressam um padrão de expressão genética de desenvolvimento alterado e isolamento clonal da Clamídia a partir de inclusões individuais.
Embora este protocolo tenha sido criado especificamente para a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento clamídia, ele poderia ser facilmente adaptado para interrogar qualquer número de vias genéticas clamídias.
Protocol
Representative Results
Discussion
A dissecação dos mecanismos que controlam o ciclo de desenvolvimento da clamídial tem sido dificultada pelas limitações das ferramentas genéticas atualmente disponíveis. Empregando nossa clamídia promotora-repórter em conjunto com microscopia automatizada de células vivas, foi construído um sistema que permite o monitoramento do desenvolvimento do tipo celular em inclusões individuais durante um período de 24 horas. Este sistema, em combinação com mutagênese química e isolamento direto da inclus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Anders Omsland da Universidade Estadual de Washington por fornecer a mídia axenic CIP-1. Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AI130072, R21AI135691 e R21AI113617. O apoio adicional foi fornecido por fundos de startup da Universidade de Idaho e do Center for Modeling Complex Interactions através de sua bolsa NIH P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
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