En Murine Model af fostereksponering for mødrebetændelse for at studere virkningerne af akut chorioamnionitis på nyfødte tarm udvikling

Summary

Vi udviklede en model af chorioamnionitis at simulere fostereksponering for moderens inflammation (FEMI) uden komplikationer af levende organismer til at undersøge virkningerne af FEMI på udviklingen af afkom tarmkanalen. Dette giver mulighed for undersøgelse af mekanistiske årsager til udvikling af tarmskade efter chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis er en almindelig foregribelse af præmature fødsel og er forbundet med mange af de sygeligheder af prematurity, herunder nekrotiserende enterocolitis (NEC). Der er dog endnu ikke fundet en mekanistisk forbindelse mellem disse to betingelser. Vi har vedtaget en murin model af chorioamnionitis involverer lipopolysaccharid (LPS)-induceret foster eksponering for moderens inflammation (FEMI). Denne model af FEMI fremkalder en steril moderlig, placental og føtal inflammatorisk kaskade, som også er til stede i mange tilfælde af klinisk chorioamnionitis. Selv om der findes modeller, der udnytter levende bakterier og mere præcist efterligner patofysiologien af en stigende infektion, der resulterer i chorioamnionitis, kan disse metoder forårsage indirekte virkninger på udviklingen af den umodne tarmkanal og det tilknyttede udviklende mikrobiom. Ved hjælp af denne protokol har vi vist, at LPS-induceret FEMI resulterer i en dosisafhængig stigning i graviditetstab og præmature fødsel samt forstyrrelse af normal tarmudvikling hos afkom. Desuden har vi vist, at FEMI øger tarmskade og serumcytokiner hos afkom betydeligt, samtidig med at de reducerer bæger- og Paneth-celler, som begge giver en første linje med medfødt immunitet mod tarmbetændelse. Selv om en lignende model af LPS-induceret FEMI er blevet brugt til at modellere sammenhængen mellem chorioamnionitis og efterfølgende abnormiteter i centralnervesystemet, så vidt vi ved, denne protokol er den første til at forsøge at belyse en mekanistisk sammenhæng mellem chorioamnionitis og senere forstyrrelser i tarm udvikling som en potentiel forbindelse mellem chorioamnionitis og NEC.

Introduction

De chorionic membraner spiller en integreret rolle i pattedyr graviditet. De omfatter chorion og amnion, som tjener flere funktioner. De omgiver og beskytter fosteret, letter parakrine signalering mellem moderens og fosterrum¹, og skaber lokale feedback loops i de chorioniske membraner, som kan være involveret i at indlede parturition¹. Den nuværende forståelse af membranerne indikerer, at amnionen giver strukturel barrierefunktion, og chorion giver en immunologisk buffer primært for at beskytte det udviklende foster mod moderens immunsystem². Betændelse i disse membraner er kendt som chorioamnionitis. Historisk set blev diagnosen klinisk chorioamnionitis foretaget efter tilstedeværelsen af moderens feber plus en eller flere foster- eller moderlige kliniske fund^3,4. Men selv om denne definition er klinisk nyttig, dens manglende præcision har gjort chorioamnionitis forskning udfordrende. I 2015 definerede et ekspertpanelværksted af Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin inflammation eller infektion eller begge dele (triple I)³. Denne afklaring er vigtig, fordi mens mikrobiel induceret infektion er en vigtig årsag til livmoder / fosterbetændelse, det forekommer mindre almindeligt end steril livmoder / fosterbetændelse^5,6,7. Samlet set chorioamnionitis fortsat et betydeligt folkesundhedsproblem, som det ses i 2\u20124% af sigt leverancer og 25\u201230% af præmature leverancer^8,9.

Chorioamnionitis kan have betydelige virkninger på fosteret og nyfødte. Det er veldokumenteret i litteraturen, at chorioamnionitis er forbundet med øget risiko for mange af sygeligheden af prematurity, herunder bronchopulmonal dysplasi¹⁰, cerebral hvidt stof skade¹¹, intraventricular blødning¹², retinopati af prematurity¹³, og både mistænkt og bekræftet tidlig debut neonatal sepsis^14,15. Da vi er interesseret i skades- og reparationsmekanismer i tarmkanalen, er det vigtigt at bemærke, at chorioamnionitis også er forbundet med senere udvikling af nekrotiserende enterocolitis (NEC)^15,16. NEC er en ødelæggende gastrointestinale sygdom hos for tidligt fødte spædbørn, der resulterer i en dysreguleret værtsrespons på inflammation og efterfølgende tarmnekrose¹⁷. Hvert år, NEC påvirker over 4000 spædbørn i USA, og op til en tredjedel af disse spædbørn dør af sygdommen¹⁸. Den patogenese af NEC sandsynligvis indebærer en kombination af tarm umodenhed, dysregulering af det umodne immunsystem, tarmbetændelse, og bakteriel translokation¹⁹, der kulminerede i en endelig fælles vej tarmnekrose. Vigtigere, starten af NEC ofte opstår uger efter fødslen og potentiel eksponering for chorioamnionitis, hvilket gør den mekanistiske sammenhæng mellem chorioamnionitis og efterfølgende udvikling af NEC uklar²⁰. En potentiel mekanisme, hvormed chorioamnionitis kan bidrage til nec’s patofysiologi, er gennem opregulering af moderens immunsystem, der efterfølgende producerer en stærk fosterinflammatorisk reaktion, som kan forstyrre normale føtale udviklingsmønstre^21,22,23.

Flere pattedyr modeller af chorioamnionitis findes i gnavere og får^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Der foreligger imidlertid kun få data om udviklingen af tarmkanalen ud over den første nyfødte periode efter chorioamnionitis-induceret fostereksponering for betændelse hos mødre (FEMI). For at undersøge forholdet mellem FEMI og den efterfølgende udvikling af skader på tarmkanalen har vi tilpasset lipopolysaccharid (LPS)-induceret FEMI-model. Lipopolysaccharider er en vigtig del af den ekstracellulære overflade på gram negative bakterier og er en potent stimulans af det medfødte immunsystem af flere eukaryote arter, herunder mennesker³³. Maternal LPS injektion resulterer i en steril inflammatorisk kaskade uden de forvirrende virkninger af levende bakterier, og det er en veletableret model for induktion af præmature fødsel³⁴, samt en model af akut chorioamnionitis og fosterinflammatorisk respons syndrom (FIRS), som er den mest alvorlige form for chorioamnionitis^24,35. Det har også vist sig at fremkalde både cerebral hvid og grå stof skade i et får model³⁶ og en murine model^37,38,39,40. Men så vidt vi ved, er vi de første til at bruge denne model af chorioamnionitis og FEMI til at undersøge dens virkninger på udviklingen af mave-tarmkanalen tidligere fødsel, samt at undersøge en mulig mekanistisk forbindelse mellem chorioamnionitis og senere udvikling af NEC^41,42.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (protokol #8041401). Alle dyr blev anbragt i en sammenslutning for vurdering og akkreditering af laboratoriedyrpleje (AALAC) godkendt vivarium ved University of Iowa. Alle mus var vilde type stamme C57Bl/6J. 1. Etablering af FEMI hos gravide mus LPS-forberedelse Brug LPS afledt af Escherichia coli O55:B5 (lagerkoncentration 2 mg/mL). Lps-lagerkoncentrationen fo…

Representative Results

Udsættelse for FEMI på fosterdag 15 fører til tab af graviditet, der er afhængig af dosis, og en dosisafhængig for tidlig fødsel (figur 1)42. Til forsøgene valgte vi at bruge en LPS-dosis på 100 μg/kg for at minimere graviditetstab og prematurity (50% tab mellem både prematurity og intrauterin fostergang), mens vi udsatte fostrene for en betydelig inflammatorisk fornærmelse. Ved hjælp af denne tilgang undersøgte vi næste femi’…

Discussion

Chorioamnionitis virkninger 2\u20124% af sigt og 25\u201230% af præmature leverancer^8,9. Virkningen af chorioamnionitis kan dog strække sig langt tidligere fødsel, da det har vist sig at have betydelige virkninger på fosteret og nyfødte^{10,11,12,13,14,15,</su…}

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056