Análisis del metabolismo celular natural humano
Summary
En este artículo, describimos un método para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en células humanas primarias de Asesino Natural (NK) aisladas de sangre periférica, en reposo o después de la activación inducida por IL15. El protocolo descrito podría extenderse fácilmente a las células NK humanas primarias activadas por otras citoquinas o estímulos solubles.
Abstract
Las células de Natural Killer (NK) median principalmente las respuestas inmunitarias antitumorales y antivirales innatas y responden a una variedad de citoquinas y otros estímulos para promover la supervivencia, la proliferación celular, la producción de citoquinas como la gamma de interferón (IFN) y/o los programas de citotoxicidad. La activación de células NK por estimulación de la citoquina requiere una remodelación sustancial de las vías metabólicas para apoyar sus requisitos bioenergéticos y biosintéticos. Hay un gran cuerpo de evidencia que sugiere que el metabolismo de células NK deteriorado está asociado con una serie de enfermedades crónicas incluyendo la obesidad y el cáncer, que destaca la importancia clínica de la disponibilidad de un método para determinar el metabolismo de las células NK. Aquí describimos el uso de un analizador de flujo extracelular, una plataforma que permite mediciones en tiempo real de la glucólisis y el consumo de oxígeno mitocondrial, como una herramienta para monitorear los cambios en el metabolismo energético de las células NK humanas. El método descrito aquí también permite el seguimiento de los cambios metabólicos después de la estimulación de las células NK con citoquinas como IL-15, un sistema que actualmente se está investigando en una amplia gama de ensayos clínicos.
Introduction
Las células de Natural Killer (NK) son linfocitos innatos que median las respuestas antitumorales y antivirales. Las células NK comprenden entre el 5 y el 15% de todos los linfocitos en la sangre periférica humana, y también se pueden encontrar en el bazo, el hígado, la médula ósea y los ganglios linfáticos. Las células NK no expresan receptores clonotípicos polimórficos, como los receptores de células T (TCR) o los receptores de células B (BCR). Por el contrario, la activación de sus funciones citolíticas se debe a la realización de receptores que reconocen ligandos invariables en la superficie de una célula diana1,2.
Células NK humanas en reposo aisladas de la sangre periférica pueden sobrevivir durante varios días en medio de cultivo complementado con suero humano. La activación de las células NK por citoquinas como IL-15 o IL-2 impulsa las células a la proliferación y a un aumento de su capacidad de matar, entre otros efectos3,,4,,5. Varios estudios han demostrado una correlación directa entre la activación de la célula NK y los cambios en su actividad metabólica6. Estos cambios metabólicos están destinados a satisfacer los requisitos particulares de las células en términos de energía y biosíntesis.
Las células y organismos aeróbicos obtienen energía a través de una serie de reacciones químicas que implican el catabolismo y la oxidación de carbohidratos, grasas y proteínas. A través de una combinación de glucólisis, el ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, las células eucariotas satisfacen la mayoría de su demanda de ATP y obtienen los intermedios necesarios como bloques de construcción para macromoléculas esenciales para el crecimiento celular y la proliferación. El proceso de glucólisis (Figura 1A) comienza con la entrada de glucosa en la célula. En el citosol, la glucosa se fosforila y se transforma en piruvato (con una producción neta de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa), que se puede reducir a lactato o transportarse en las mitocondrias para transformarse en acetil-coa y entrar en el ciclo TCA. El ciclo TCA continúa en bicicleta alimentado con más moléculas de acetil-CoA y produce CO2 (que eventualmente se difunderá fuera de la célula y, al reaccionar con H2O en el medio, generará ácido carbónico que conducirá a la acidificación del medio) y NADH, la molécula encargada de donar electrones a la cadena de transporte de electrones (ETC). Los electrones viajan a través de diferentes complejos proteicos y finalmente son aceptados por el oxígeno. Estos complejos (I, III y IV) también bombean H+ desde la matriz mitocondrial en el espacio intermembrano. Como consecuencia del gradiente electroquímico generado, el H + entraráde nuevo en la matriz a través del complejo V (ATP-sintasa), invirtiendo la energía potencial acumulada en la generación de ATP.
Tanto la glucólisis como la respiración mitocondrial se pueden bloquear en diferentes puntos mediante el uso de inhibidores. El conocimiento y uso de estos inhibidores fue la base para el desarrollo del ensayo de flujo extracelular. Mediante la medición de dos parámetros simples en tiempo real como el pH y el oxígeno, el analizador de flujo extracelular infiere la tasa de glucólisis y respiración mitocondrial en una placa de 96 pozos. La prueba de esfuerzo de glucólisis se realiza en un medio basal sin glucosa (Figura 1B)7. Las primeras mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) son indicativas de acidificación independiente de la glucólisis. Se conoce como acidificación no glucolítica y se correlaciona con elCO2 producido por el TCA que, como se explicó anteriormente, se combina con H2O en el medio para generar H+ (ECAR ligado a TCA). La primera inyección es glucosa para inducir la utilización de glucosa y aumentar la glucólisis. La segunda inyección combina tanto la rotenona, un inhibidor del Complejo I, y la antimicina A, un inhibidor del Complejo III juntos, para bloquear el ETC. Las células responden a esta disminución dramática en la producción de ATP mitocondrial mediante la activación de la glucólisis para mantener los niveles celulares de ATP, y esto representa la cantidad de glucólisis que no es utilizada por la célula en el estado basal, pero podría ser potencialmente reclutada en respuesta a aumentos en la demanda de ATP (glicólisis). La tercera inyección es la glucosa análoga 2-Deoxyglucosa (DG), que compite con la glucosa como sustrato de la enzima hexoquinasa. El producto de esta fosforilación, 2-desoxiglucosa-6-fosfato no se puede transformar en piruvato, y por lo tanto se bloquea la glucólisis, lo que reduce el ECAR al mínimo. El ECAR medido en este punto incluye otras fuentes de acidificación extracelular que no se atribuyen a la glucólisis o actividad respiratoria, así como cualquier glucólisis residual no inhibida completamente por 2-DG (post 2-DG-acidificación).
La prueba de esfuerzo mitocondrial se realiza en un medio con glucosa (Figura 1C)8. Las primeras mediciones de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) corresponden a la línea base de la respiración mitocondrial (respiración basal). La primera inyección es la oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través de la ATP sintasa (complejo V), bloqueando la síntesis de ATP y por lo tanto hiperpolarizar rápidamente la membrana mitocondrial, que evita el bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y conduce a una disminución en el OCR. La comparación entre la respiración de línea de base y el valor dado por la adición de oligomicina representa la respiración vinculada a ATP. La tasa restante de consumo de oxígeno que no tiene en cuenta la oligomicina se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de la bicapía lipídica o proteínas en la membrana mitocondrial interna, como el translocase nucleótido de adenina9. La segunda inyección es el desacoplador 2,4-dinitrofenol (DNP), un ionóforo que induce una entrada masiva de H+ en la matriz mitocondrial, que conduce a la despolarización de la membrana mitocondrial y la interrupción de la síntesis de ATP mitocondrial. Las células responden a la disipación de la fuerza de protones-motivo aumentando la tasa de transporte de electrones y el consumo de oxígeno a niveles máximos en un intento inútil de recuperar el potencial de la membrana (capacidad respiratoria máxima). La diferencia entre la capacidad respiratoria máxima y la respiración basal es la capacidad respiratoria de repuesto de la célula, que representa la cantidad de respiración que no es utilizada por la célula para generar ATP en estado basal, pero podría ser potencialmente reclutado en respuesta a aumentos en la demanda de ATP o en condiciones de estrés8. La tercera inyección es una combinación de rotenona y antimicina A. Esta inyección detiene completamente el ETC y el OCR disminuye a su nivel más bajo, siendo el consumo restante de oxígeno no mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Los cambios en las vías metabólicas podrían predecir de alguna manera el funcionamiento de las células NK, ya que se ha sugerido que la activación continua de células NK con citoquinas in vitro podría conducir al agotamiento de las células NK mediante el estudio de diferentes vías metabólicas10,,11. La correlación entre el estado metabólico de las células NK y la función es muy importante desde el punto de vista de la inmunoterapia contra el cáncer. En este campo, se ha probado la activación de células NK con perfusión de IL-15, solas o en combinación con anticuerpos terapéuticos monoclonales con el fin de mejorar la matanza de células tumorales12,,13,,14. El conocimiento del estado metabólico de las células NK en respuesta a estas estrategias de tratamiento proporcionaría un valioso predictor del estado de activación de la célula NK y la función de matar.
El estudio de las vías metabólicas en otras células mieloides y linfoides como monocitos, células T y B se ha descrito15 y se han publicado métodos optimizados16. En este protocolo proporcionamos un método que combina un protocolo de aislamiento NK que produce un gran número de células NK puras y viables y un protocolo optimizado para medir la actividad metabólica utilizando un analizador de flujo extracelular. Aquí mostramos que este es un método válido para el estudio de los cambios metabólicos en el reposo y las células NK humanas activadas IL-15. Para el ensayo de flujo extracelular, se han probado y optimizado parámetros como el número de células y las concentraciones de fármacos. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular está totalmente automatizado y es capaz de probar en tiempo real, con cantidades muy bajas de células, hasta 92 muestras simultáneamente, y por lo tanto permite exámenes de alto rendimiento (con múltiples muestras y réplicas) de una manera relativamente rápida17.
Este método puede ser utilizado por investigadores interesados en evaluar la función celular NK mediante el estudio del metabolismo de las células NK. Se podría aplicar también a las células activadas por otras citoquinas, anticuerpos o estímulos solubles.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, hemos establecido un protocolo para aislar y cultivar eficientemente células NK humanas primarias y viables a partir de sangre periférica. También hemos optimizado las condiciones para la medición de la actividad metabólica de estas células NK evaluadas por la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular mediante el uso de un analizador de flujo extracelular. En comparación con otros métodos respirométricos, el analizador de flujo extracelular es rápido, requiere un pe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Michael N. Sack (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre) el apoyo y la discusión. Este estudio fue apoyado por los Programas de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Instituto Nacional del Corazón, pulmón y sangre. JT cuenta con el apoyo del programa Ramón y Cajal (beca RYC2018-026050-I) de MICINN (España).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
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